[发明专利]一种标记活细胞内核酸的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体地是涉及一种标记活细胞内核酸的方法和试剂盒。

技术背景

细胞是生命的基本单位，细胞的特殊性决定了个体的特殊性，因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、改造生命和征服疾病的关键。细胞的主要生命活动包括增殖、分化、衰老和凋亡等，细胞的这些生命活动对生物体的生存和发展具有重要意义。细胞增殖是生物体生长、发育、生殖和遗传的基础；细胞分化是个体发育的一个重要阶段，胚层细胞的分化导致组织形成、器官发生和系统建成，细胞的异常分化会导致癌变；细胞的衰老和凋亡与生物体衰老有着极为密切的关系。对细胞的生命活动的研究已经成为现在生物学研究的热点之一，有研究表明，细胞增殖、分化、衰老和凋亡等生命活动通过细胞内核酸调控，细胞内核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，因此，观察检测细胞内核酸变化可以有效的分析细胞增殖、分化、衰老和凋亡状况，进一步可以研究整个生物体的代谢。

现最成熟的检测和分析细胞内核酸变化的方法，是核酸标记技术检测法，这种方法首先将特殊标记(如：放射性标记、化学发光标记等)的核苷或核苷酸探针插入细胞内核酸，然后通过检测细胞内的核酸探针信号达到检测细胞内核酸变化的目的。现普遍应用的核苷和核苷酸探针可分为两类，一类是同位素探针，另一类是免疫识别探针。虽然这两类探针已经应用于细胞周期研究，DNA复制以及细胞增值等研究方面，但这两种方法都存在很大缺陷。同位素探针由于其放射性，操作条件要求很高，不能在普通实验室完成，同位素标记的显微图片的分辨率差，信噪比低，另外，放射自显影法实验持续时间较长(检测通常要几个月)，就不能用于快速高通量检测。免疫识别探针通常采用5-溴-2’-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)、5-溴尿嘧啶核苷、5-溴尿嘧啶核苷酸等，采用这种免疫识别探针最大缺陷在于，插入核酸的5-溴代核酸一定要暴露在核酸分子表面同识别抗体结合。为检测插入核酸分子链中的探针需要通过各种条件使核酸分子变性，现在经常使用的条件包括醋酸的甲醇溶液，浓盐酸等，这些变性条件使实验结果不稳定，经常出现难以重复的结果。

随着对细胞研究的深入，对于细胞内核酸的检测技术要求越来越高，基于这种要求本发明开发出了一种全新的核酸标记方法。本发明应用分子连接的思想，通过“点击”反应将细胞内核酸同活性分子连接，从而可以使各种检测方法准确、方便的检测核酸分布、含量等指标。

“点击”化学的概念是2001年诺贝尔奖获得者Sharpless提出。“点击”反应是在传统Huisgen三唑反应基础上，发展出一类条件温和，选择性高和产率高的化学反应。传统的Huisgen三唑反应(如图1)是有机叠氮和炔基化合物在加热条件下发生1，3-二偶极[3+2]环加成反应，得到五元杂环[1，2，3]-三氮唑。Huisgen三唑反应为连接两个化合物提供了一种很好的手段，但是该反应条件通常需要通过加热活化等条件才能完成。“点击”反应是亚铜离子催化下的Huisgen三唑反应，由于亚铜离子的催化Huisgen三唑反应活化能降低，使该反应可以在常温下水和多种有机溶剂中高产率完成。另外，“点击”反应仅得到1’4’位三氮唑产物，不同于加热条件下得到1’5’位同1’4’位混和产物。目前“点击”反应已经广泛地被应用于各种生物大分子修饰，并被认为是“搭建起化学和生物学桥梁的杰出反应”。

发明内容

本发明的目的是提供一种标记活细胞内核酸的方法和试剂盒。该方法和试剂盒可用于方便、准确、快速地标记活细胞内核酸。

解决上述目的的技术方案如下：

一种标记活细胞内核酸的试剂盒，主要包括有：

能够在核酸合成的过程中插入细胞内核酸序列中的、带有1，3-二偶极基团或亲偶极基团的核苷类似物；

含有与上述1，3-二偶极基团或亲偶极基团的对应的亲偶极基团或1，3-二偶极基团的生物分子探针；所述核苷类似物与生物分子探针通过1，3-二偶极基团与对应的亲偶极基团进行“点击”反应。

所述1，3-二偶极基团优选为：氧化腈基、叠氮基、重氮甲基、硝酮基、腈胺基等等；亲偶极基团优选为烯基、炔基。更优选地，所述烯基为乙烯基、丁烯基等；所述炔基为乙炔基、丙炔基，环状炔基等。