[发明专利]生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，特别涉及一种生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂及其制备方法和应用。

背景技术

D-芳基氨基酸(如，D-芳基甘氨酸)是一类十分重要的非天然氨基酸，由于其构型与天然氨基酸正好相反而可以用于药物(如，拮抗剂)、肽以及甜味剂等的合成和制备，近年来随着对其应用价值的进一步开发，市场的需求量在迅猛增长。

传统的D-芳基氨基酸(如，D-芳基甘氨酸)的制备方法，包括了化学合成及拆分法，但是其需要浪费一半的对映异构体，造成生产效率低、产能低、能耗高等缺点。

在生物催化D-芳基海因水解法中，传统的技术为“一菌两酶”法，如中国专利或专利申请01105347、200710191968等所述的。但是，该技术中所使用的一种微生物本身要兼顾两种酶，难以耐受高浓度的底物并在工业生产中保持连续的酶催化作用，因此难以加入饱和浓度的底物而实现非均相酶催化。因此这些专利申请即使授权，也因不适合实际的工业生产而放弃了专利权。

中国专利申请200610048209.0和200710062118.7公开了一种非均相酶催化水解5-芳基海因合成D-芳基甘氨酸或其衍生物的方法，以“两菌两酶”法来代替传统的“一菌两酶”法，其中使用黄金节杆菌(Arthrobacter aurescens)LZ98或其突变菌UV-LZ98来产生海因酶(Hydantoinase)并使用放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)LZ99或其突变菌UV-LZ99来产生氨甲酰胺水解酶，由此产生一定酶活性的酶制剂来使得相应合成方法得以实现。然而，该方法中使用的制备酶制剂的两株菌株购买成本较高，尤其是LZ99以及突变菌UV-LZ99不但昂贵，而且产生的氨甲酰胺水解酶在工业规模的长时间发酵时稳定性不够，发酵耐久性不足，大大限制了该专利的非均相酶催化水解5-芳基海因来合成D-芳基甘氨酸的工业化应用。

发明内容

本发明为克服现有技术中存在的问题，提供一种生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂及其制备方法和应用，它能代替现有的用于非均相酶催化水解5-芳基海因制备D-芳基甘氨酸的方法中的酶制剂，使生产成本大大降低，且方法简单、易于工业化应用。

本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明的第一个方面，生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，它由产海因酶的黄金节杆菌的活化细胞和产氨甲酰水解酶的放射形土壤杆菌的活化细胞组成。

所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，所述黄金节杆菌产生的海因酶的初始酶活性为大于0.32U，所述放射形土壤杆菌产生的氨甲酰水解酶的初始的活性大于10U。

所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，所述黄金节杆菌的初始海因酶活性为0.32U～0.45U。

所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，所述黄金节杆菌为黄金节杆菌3256活化细胞，所述放射形土壤杆菌为放射形土壤杆菌3255活化细胞。

本发明的第二个方面，所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂的制备方法，它包括以下步骤：

a.将产海因酶的黄金节杆菌接种于含玉米浆、糖蜜、氢氧化钠水溶液、氯化钠、2-硫尿嘧啶、硫酸镁、硫酸锰和磷酸氢二铵的液体培养基中，于30～34℃搅拌活化培养。其中，搅拌速度为60rpm，活化时间为12～18h，优选14～16h；空气压力为0.18～0.23Mpa，优选为0.2Mpa；空气流量为20～26L/h；反应釜压力为0.04～0.06Mpa，优选为0.05Mpa；然后将该培养液用壳聚糖水溶液絮凝，过滤收获固形酶制剂1；

所述液体培养基含玉米浆360～460重量份、糖蜜380～480重量份、浓度为25～35％(w/w)的氢氧化钠水溶液15～25重量份、氯化钠40～60重量份、2-硫尿嘧啶27～37重量份硫酸镁8～10重量份、硫酸锰1.2～1.8重量份和磷酸氢二铵3～4重量份，并加水定容至8000重量份；

b.将产氨甲酰水解酶的放射形土壤杆菌接种于含玉米浆、葡萄糖、蛋白胨、氯化钠、硫酸锰、磷酸氢二铵和阿拉伯糖的液体培养基中，于32～38℃搅拌活化培养，其中搅拌速度为60rpm；活化时间为15～22h，优选16～18h，最优选为17h；空气压力为0.18～0.23Mpa，优选为0.2Mpa；空气流量为18～22L/h；反应釜压力为0.04～0.06Mpa，优选为0.05Mpa；在所述培养基中添加氢氧化钠调节pH为6.5～7.8，优选为6.8～7.3，最优选为7.0，然后将该培养液用壳聚糖水溶液絮凝，过滤收获固形酶制剂2；