[发明专利]生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，它由产海因酶的黄金节杆菌的活化细胞和产氨甲酰水解酶的放射形土壤杆菌的活化细胞组成。

2.如权利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，所述黄金节杆菌产生的海因酶的初始酶活性为大于0.32U，所述放射形土壤杆菌产生的氨甲酰水解酶的初始的活性大于10U。

3.如权利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，所述黄金节杆菌的初始海因酶活性为0.32U～0.45U。

4.如权利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，所述黄金节杆菌为黄金节杆菌3256活化细胞，所述放射形土壤杆菌为放射形土壤杆菌3255活化细胞。

5.如权利要求1～4所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂的制备方法，其特征是它包括以下步骤：

a.将产海因酶的黄金节杆菌接种于含玉米浆、糖蜜、氢氧化钠水溶液、氯化钠、2-硫尿嘧啶、硫酸镁、硫酸锰和磷酸氢二铵的液体培养基中，于30～34℃搅拌活化培养，其中，搅拌速度为60rpm；活化时间为12～18h，优选14～16h；空气压力为0.18～0.23Mpa，优选为0.2Mpa；空气流量为20～26L/h；反应釜压力为0.04～0.06Mpa，优选为0.05Mpa；然后将该培养液用水溶性壳聚糖絮凝，过滤收获固形酶制剂1；

所述液体培养基含玉米浆360～460重量份、糖蜜380～480重量份、浓度为25～35％(w/w)的氢氧化钠水溶液15～25重量份、氯化钠40～60重量份、2-硫尿嘧啶27～37重量份硫酸镁8～10重量份、硫酸锰1.2～1.8重量份、和磷酸氢二铵3～4重量份，并加水定容至8000重量份；

b.将产氨甲酰水解酶的放射形土壤杆菌接种于含玉米浆、葡萄糖、蛋白胨、氯化钠、硫酸锰、磷酸氢二铵和阿拉伯糖的液体培养基中，于32～38℃搅拌活化培养，其中搅拌速度为60rpm；活化时间为15～22h，优选16～18h，最优选为17h；空气压力为0.18～0.23Mpa，优选为0.2Mpa；空气流量为18～22L/h；反应釜压力为0.04～0.06Mpa，优选为0.05Mpa；在所述培养基中添加氢氧化钠调节pH为6.5～7.8，优选为6.8～7.3，最优选为7.0，然后将该培养液用水溶性壳聚糖絮凝，过滤收获固形酶制剂2；

所述液体培养基含玉米浆200～400重量份、葡萄糖180～260重量份、蛋白胨80～100重量份、25g氯化钠20～30重量份、硫酸锰1.6～2.0重量份、磷酸氢二铵6.8～7.6重量份、和阿拉伯糖12～16重量份；并将所述液体培养基加水定容至8000重量份；

c.将步骤a制得的固形酶制剂1和步骤b制得的固形酶制剂2混合，制得生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其中所述固形酶制剂1和所述固形酶制剂2的重量配比为1～5∶1～50，优选比例为1～5∶1～20，更优选比例为1～2∶1～5。

6.如权利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，它用于酶催化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法中。

7.如权利要求6所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，所述的酶催化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法包括以下步骤：

①在酶催化反应罐中，加入水和5-芳基海因，并调整pH值为6.5～7.8，5-芳基海因的加入量占水和5-芳基海因总重量的5～21％(w/w)，得混合溶液；

②在搅拌的条件下向酶催化反应罐中加入权利要求1～5任一所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，在25～40℃下搅拌反应，直至无法检测出5-芳基海因，制得D-芳基甘氨酸；

其中所述生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂占步骤①中的混合溶液的总重量的1～10％，优选为为2-8％；反应时间8～66小时；

③通过200目筛分离沉淀出D-芳基甘氨酸固体，经过重结晶，获得D-芳基甘氨酸晶体；

④通过超滤膜过滤和蒸发浓缩来提取酶催化反应罐中的液体中溶解的D-芳基甘氨酸，再经过重结晶，得D-芳基甘氨酸晶体。