[发明专利]一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记及其应用

权利要求书

1.一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记，其特征是，其为一对等位标记ATA157和ATA154，与大白菜TuMV抗性位点间的连锁距离为3.8cM，其中，标记ATA157的片段长度为157bp，具有序列表SEQ ID No.1中的序列；标记ATA154的片段长度为154bp，具有序列表SEQ ID No.2中的序列。

2.用于扩增权利要求1所述的一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记的引物序列HCC259，其特征是，其上游引物为：GCAAAACGGAGTACCCTA；下游引物为：TTGGAAATGAAATGAGAAGA。

3.权利要求1所述的一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记的制备方法，其特征是：(1)采用改良CTAB法提取待测验单株的基因组DNA；(2)利用权利要求2所述的引物HCC259的上游引物和下游引物对步骤(1)获得的基因组DNA进行PCR扩增；(3)根据扩增结果，对照标准条带或通过测序，判断待测单株的抗、感特性，并推测其基因型。

4.如权利要求3所述的一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记的制备方法，其特征是，所述步骤(1)采用改良CTAB法提取待测验单株的基因组DNA的具体步骤为：取幼叶0.1g，在液氮中研成粉末，装入1.5mL离心管中；加入700μL 65℃预热的CTAB提取缓冲液，混匀，65℃水浴45min-1h，其间每5-10min摇一次；冷却至室温，离心取上清，用与所取上清液等体积的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇抽提，所述酚：氯仿：异戊醇的体积比为25∶24∶1；摇匀后冰浴至分层；12000r/min离心10min，取上清液，用酚/氯仿/异戊醇再抽提一次，取上清液加入热处理的Rnase至终浓度100μg/mL，混匀后，37℃水浴45min；之后再次用酚/氯仿/异戊醇抽提，取上清，加入预冷的无水乙醇，-20℃保存30min，离心，倒掉上清，用70％的酒精清洗，室温吹干；加入TE溶解DNA，-20℃保存备用；用0.8％的琼脂糖电泳检测DNA质量完整性；所述CTAB提取缓冲液为质量体积比为2.0％的CTAB；1.4mol/L NaC1；1mol/L Tris-HCl，pH＝8.0；0.5mol/L EDTA；体积比为1.0％的β-巯基乙醇。

5.如权利要求3或4所述的一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记的制备方法，其特征是，所述步骤(2)进行PCR扩增为：扩增采用20μL反应体系，其中，引物浓度0.75μmol·L^-1，dNTPs 0.2mmol·L^-1，Taq酶1.5U，模板DNA 75ng，含Mg²⁺的10×Buffer 2.0μL；反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性1min，48.5℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上检测，每孔点样6μL。

6.权利要求1所述的一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记在大白菜抗TuMV育种辅助选择方面的应用。

7.权利要求1所述的一对大白菜芜菁花叶病毒病EST-SSR标记在后代选择中区分纯合体和杂合体方面的应用。