[发明专利]融合蛋白MBP-NAP及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学和基因工程领域，具体涉及一种融合蛋白MBP-NAP，此外，还涉及该融合蛋白的制备方法以及其在增强Th1细胞免疫方面的应用。

背景技术

根据细胞因子分泌模式，CD4⁺T细胞可分为Th1和Th2亚群，Th1/Th2细胞平衡对整个免疫系统的调节起着关键性作用。Th1和Th2有拮抗作用，它们之间的不平衡会导致不同类型的疾病发生。研究发现，Th1/Th2平衡紊乱与肿瘤、自身免疫性疾病、微生物感染、移植排斥反应等多种疾病有关。自Yamamura和Kharkevitch最早发现肿瘤发生时免疫反应向Th2漂移后，许多研究均证实，进展期肿瘤病人外周血中往往呈Th2优势状态，在抗肿瘤免疫中起重要作用的Th1免疫却受到抑制，因而设法逆转Th1/Th2漂移方向，增强Th1免疫，将成为肿瘤免疫治疗的新手段。此外，在多数寄生虫病中，Th2优势应答可加重疾病，而Th1应答具有治疗作用；过敏性疾病的发生与抗原特异性Th2优势应答密切相关，因此有人提出治疗过敏性疾病用药物诱发Th1优势应答的途径；在自身免疫性疾病的发病机制及治疗中，Th1/Th2也有非常重要的作用。

微生物在进化中已经形成了若干免疫调节机制。研究发现幽门螺杆菌(H.Pylori，简称HP)感染胃粘膜常常伴随大量中性白细胞及单核细胞浸润。HP超声上清和水抽提物当中存在能趋化和激活中性白细胞及其它炎症细胞的成分，Doyle J等首先从H.pylori中纯化出150kDa的蛋白质分子，并证实这种分子及其15kDa的同源亚基能上调中性白细胞表面CD11b/CD18表达，促进中性白细胞对内皮细胞的黏附，这种可溶性蛋白成分被命名为幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白(H.pylori neutrophil-activating protein，HP-NAP)。HP-NAP是幽门螺杆菌重要致病因子及免疫保护性抗原之一。Rossi G等报道HP-NAP与幽门螺杆菌另外两种毒力因子空泡素VacA和毒力相关蛋白CagA联合使用能有效治疗实验感染H.pylori的比格狗，具有免疫治疗作用。发明者利用自己纯化的重组HP-NAP在小鼠和豚鼠中也获得了较高的抗H.pylori免疫保护效果。但利用HP-NAP改造融合蛋白增强Th1细胞免疫的专利国内外还未见报道。

研究表明HP-NAP是一种TLR2(Toll-like receptor 2)激动剂，能够诱导人类中性粒细胞和单核细胞产生IL-12和IL-23，使宿主抗原特异性T细胞由Th1/Th2向Th1漂移。在抗肿瘤免疫反应，过敏性疾病和寄生虫感染等疾病防治中具有广泛的应用前景。

H.pylori培养条件苛刻，通过病原菌培养大量分离纯化HP-NAP成本较高，HP-NAP的编码基因HP-napA存在于几乎所有的H.pylori分离菌株中而且高度保守，本发明以天然微生物毒力因子基因HP-napA为药物设计母本，利用生物信息技术对HP-napA进行功能预测和序列改造，DNA重组技术构建原核表达载体，在大肠杆菌(E.coli)TB1中实现重组蛋白的高效表达，筛选具有增强Th1细胞免疫活性的新型基因工程重组蛋白候选药物。为开发Th1/Th2漂移相关疾病免疫调节剂提供技术路线和制备方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种融合蛋白MBP-NAP。

本发明进一步目的是提供了该融合蛋白MBP-NAP的制备方法。

本发明另一目的在于提供了该融合蛋白在增强Th1细胞免疫方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

融合蛋白MBP-NAP，具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

上述融合蛋白MBP-NAP的制备方法，包括以下步骤：

(1)基因HP-napA的PCR扩增

根据H.pylori 26695和H.pylori J99全基因组序列设计一对PCR引物，所述引物序列如下：

上游引物P1：5′-GGAGAATTCATGAAAACATTTGAAAT-3′

下游引物P2：5′-AAGTCGACTTAAGCTAAATGGGCTTCTAG-3′

以MEL-HP27基因组DNA为模板，扩增包含基因HP-napA的DNA片段，PCR产物长度为435bp；

(2)重组质粒pNEB-napA的构建