[发明专利]一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用生物工程技术获得重组膦丝菌素乙酞转移酶的方法，其中包括bar基因的克隆、重组质粒的构建方法、工程菌的发酵表达方法以及重组膦丝菌素乙酞转移酶的分离与纯化方法。

背景技术

随着转基因作物的商品化生产，其产品安全性及其是否对生态环境有影响引发了人们广泛关注。许多国家以立法或其它形式要求转基因产品在上市前必须进行标识，转基因产品的检测已纳入国内外检验检疫部门的检测项目。

转基因产品的检测主要从两个方面入手，一是核酸水平，即检测转基因产品中是否含有插入的外源基因；二是蛋白质水平，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测。其中以基于核酸水平定性或定量检测技术较为成熟。如中国发明专利公开号CN1580782描述了可同时对转基因产品中常用的启动子、终止子、筛选标记基因、抗除草剂基因、抗虫基因等9个外源DNA序列进行检测分析的低密度基因芯片检测方法；中国发明专利公开号CN101343666A描述了用于抗虫转基因水稻多重PCR检测的试剂盒及检测方法；中国发明专利公开号CN1480538描述了一种基于PCR技术的转基因油菜籽及其加工产品中转基因成分的定量检测；中国发明专利公开号CN1769488描述了一种基于PCR技术的转基因大豆的检测方法及所用引物。但核酸检测技术的主要缺点是会出现假阴性或假阳性结果。目前，基于蛋白质水平的检测技术较少，虽然市场上也有研制出的一系列相关的转基因靶标蛋白的快速检测试剂盒，但由于多数知识产权非国内所有，检测试剂价格昂贵。因此，积极研发具有我国自主知识产权的检测技术，不仅可以建立健全的转基因产品监管制度，而且可以在国际贸易中增强我国的国际竞争力。

对于蛋白质水平检测的免疫测定技术来说，首先要获得高产量的靶标蛋白，并且要保证蛋白的生物学活性，即可溶性和功能性，然后以此为抗原制备特异的抗体，再应用于转基因产品的测定。因此，如何获得高产量的靶标蛋白是关键。由于重组蛋白在理化性质和生物学活性上已日趋接近于天然蛋白质，人们利用各种高效表达系统进行制备足够的重组蛋白。其中，因大肠杆菌表达系统遗传背景清楚、培养条件简单、生长快、成本低、易大规模培养和拥有大量可利用的表达载体、宿主和纯化系统，是最为常用的表达系统。但不足之处在于，大肠杆菌中表达的重组蛋白因过量表达、环境胁迫、宿主代谢系统受干扰等原因，靶标蛋白往往以不溶的无功能的包涵体形式存在。因此，大多数情况下都需要将无活性的蛋白质转变成有生物活性的可溶形式，传统方法是对包涵体进行变性复性处理，但这种方法费时费工，得率很低，而且需要根据每种蛋白的不同理化性质优化复性的条件，可能会影响到蛋白的完整性。随着对大肠杆菌中蛋白质折叠机制的深入研究，目前已发展了许多技术来提高重组蛋白表达的可溶性。

其中融合蛋白标签技术在增溶重组蛋白研究中应用广泛。蛋白标签技术不仅可以提高重组蛋白的表达量、可溶性和稳定性，而且能避免重组蛋白在细胞内的降解，简化蛋白质的纯化过程，便于目的蛋白的检测和纯化。其中由六个组氨酸聚合组成的His标签是经常使用的蛋白标签。它的原理是固定在基质上的金属元素能和组氨酸侧链间相互作用，使得含有连续几个组氨酸残基的多肽能有效的保留在色谱柱上，接下来通过调节咪唑的浓度洗脱基质材料，就可以把含有多聚组氨酸序列的多肽洗脱下来。该系统具有蛋白表达产率高、表达产物纯化方便以及利于抗体制备等优点。但目前大量的实验发现，即使通过融合标签蛋白仍有多数重组蛋白以包涵体形式存在，因此，需要通过另一些途径来进一步提高重组蛋白表达的可溶性。由于蛋白质种类繁多，理化性质各异，至今还没有找到一种通用的解决方法。

抗除草剂bar基因，编码膦丝菌素乙酞转移酶(PAT)，通过催化乙酰辅酶A与草胺磷游离氨基结合，使草胺磷失去活性。目前，应用转基因技术已将bar基因导入水稻、玉米、油菜、大豆等作物中，其中一些转基因作物已大面积种植。但bar基因的表达产物详细的安全性评价资料甚少，其安全性评价成为制约转基因植物大面积推广的关键。因此，建立bar基因表达蛋白的快速简便的检测方法，对含bar基因的转基因产品的蛋白检测技术的方法有重要意义。博慧杰等(2007)采用大肠杆菌体外表达系统，通过His标签技术得到以包涵体形式存在于菌体中膦丝菌素乙酞转移酶。因此，进一步改进现有的试验技术方法，获取可溶性表达的膦丝菌素乙酞转移酶，显得非常重要。

发明内容