[发明专利]一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法

权利要求书

1.一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征包括以下工艺步骤：

1)设计bar基因PCR引物，上游引物bar1核苷酸序列如SEQ No.1所示，下游引物bar2核苷酸序列如SEQ No.2所示，采用引物bar1和bar2，以质粒pDsBar 1300为模板进行PCR扩增，获得bar基因全长序列，bar基因全长序列如SEQ No.3所示；

2)将得到的bar基因定向克隆到含有T7启动子的原核表达载体pET30a(+)中，构建重组质粒pET30a(+)-bar；

3)将构建的重组质粒pET30a(+)-bar转入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中，构建工程菌BL21/pET30a(+)-bar；

4)将工程菌BL21/pET30a(+)-bar发酵培养，诱导融合蛋白表达，使工程菌内获得特异性表达蛋白；

5)将得到的特异性表达蛋白进行增加可溶性处理，然后进行分离提取，得到膦丝菌素乙酞转移酶粗制品；

6)将膦丝菌素乙酞转移酶粗制品进行分离纯化，即得到膦丝菌素乙酞转移酶纯品；

7)纯品经透析、冷冻干燥后，置于-70℃超低温冰箱中保存。

2.如权利要求1所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征在于所述的步骤1)中PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，共30个循环；循环结束后72℃再延伸10min。

3.如权利要求1所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征在于所述的步骤4)中工程菌BL21/pET30a(+)-bar在培养基中培养至OD₆₀₀为0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为1mM，然后在30℃低温下诱导表达4h，使工程菌内获得特异性表达蛋白。

4.如权利要求1所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征在于步骤5)中特异性表达蛋白进行增加可溶性处理具体步骤包括：

a)发酵培养后的工程菌，用含有50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl和20mM咪唑且pH为8.0的低咪唑浓度结合缓冲液重悬细胞，再在菌体中加入溶菌酶、核糖核酸酶A、脱氧核糖核酸苷酶I，终浓度分别为100μg/mL、200μg/mL、20μg/mL，冰上作用20～30min；

b)接着在上述溶液中依次加入二硫苏糖醇、N-十二烷基肌氨酸钠和脱氧胆酸钠，终浓度分别为2.5～10mM、1～2.5％和0.2％，冰上作用20～30min，再进行冰上超声破碎10min；

c)破碎后在温度4℃下进行高速离心，离心速度为12000～14000r/m，离心10～20min后，弃沉淀取上清，然后在上清中加入终浓度为1～2％的聚乙二醇辛基苯基醚，过0.45μm滤膜后，得到膦丝菌素乙酞转移酶粗制品。

5.如权利要求1所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征在于步骤6)中膦丝菌素乙酞转移酶粗制品进行分离纯化具体步骤包括：先将膦丝菌素乙酞转移酶粗制品与Ni-NTA琼脂糖在4℃下结合1小时，再将该混合物装入空色谱柱，然后先用漂洗缓冲液洗柱，再用低咪唑浓度的洗脱缓冲液洗脱去除杂蛋白，最后用高咪唑浓度的洗脱缓冲液收集目的蛋白，即可获得膦丝菌素乙酞转移酶纯品。

6.如权利要求5所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征在于所述的漂洗缓冲液含有50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl和50mM咪唑，所述的低咪唑浓度的洗脱缓冲液含有50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl和75～125mM咪唑，pH为8.0，所述的高咪唑浓度的洗脱缓冲液含有50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl和150～250mM咪唑，pH为8.0。