[发明专利]一种提高抗真菌蛋白质抗菌活性的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物保护学以及基因工程技术领域，具体涉及一种赋予抗菌蛋白靶向结合真菌细胞壁能力的方法。

背景技术

抗真菌蛋白质是一类对真菌生长具有抑制作用的蛋白质，一般分子量较小，结构稳定，结合到真菌细胞表面后起到可以起到抑制真菌生长的作用。抗植物病原真菌的蛋白质由于不易使真菌产生耐药性，对环境友好，对人畜安全而可以作为生物农药使用。抗真菌蛋白的抗菌机制主要有：在细胞壁和细胞膜上形成孔道，造成离子泄漏，对真菌产生破坏作用；或者具有类似于去垢剂的功能，使真菌的细胞壁及细胞膜受到破坏(Zasloff et al，2002)。目前已报道的抗真菌蛋白包括植物防御素(plant defensins)、脂质转移蛋白(lipidtransfer proteins，LTPs)、硫素(thionins)、蜕皮素(snakins)、橡胶蛋白类(hevein-likepeptides)、打结素类(knottin-like peptides)、凤仙花素(IbAMPs)，MBP1和新近发现的荠菜素(shepherdins)、环肽(cyclotides)等。

几丁质(chitin)是真菌细胞壁所特有的重要结构物质，植物细胞壁及哺乳动物细胞中均不含此类物质。几丁质结合域(chitin-binding domain，CBD)是一段多肽，多见于几丁质酶(chitinase)，可帮助蛋白质结合于几丁质底物，但几丁质结合域本身并无抑菌活性。几丁质结合域是一种高度保守的结构域，各种不同来源的几丁质结合域同源性非常高，可普遍地结合于真菌细胞表面的几丁质，从而产生对真菌细胞壁的亲和作用。Tantimavanich(1998)发现，若将源于黑麦种子的几丁质酶RSC-a的几丁质结合域去掉，RSC-a对水溶性乙二醇几丁质的水解活性几乎没有变化，而对不溶于水、存在于真菌细胞壁的胶状几丁质的活性只相当于完整RSC-a的28％。而且RSC-a的几丁质结合域对几丁质的结合是独立于催化区的，暗示几丁质结合域可以使蛋白质集中于真菌的细胞壁而起作用。此外，在Iseli B.(1993)对烟草class I几丁质酶的研究中发现，具1个几丁质结合域的几丁质酶的抗真菌能力比不具几丁质结合域的相同的酶要高3倍。如果将几丁质结合域去掉，几丁质酶的抗真菌能力将大大下降(Itoh et al.，2002)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高抗真菌蛋白质抗菌活性的方法，以改造抗真菌蛋白质，提高其对真菌细胞壁的结合能力，从而提高抗菌蛋白质作用的有效浓度。

本发明方法包括将编码几丁质结合域(chitin-binding domain，CBD)的DNA序列与编码抗真菌蛋白质的cDNA序列以正确读码框连接，然后克隆到蛋白质表达载体中，使用工程菌对融合蛋白质进行表达，进一步利用商业化介质进行蛋白质纯化。还包括纯化后的蛋白质的几丁质结合能力的检测，以及融合了几丁质结合域的蛋白质抗真菌活性与原来抗真菌蛋白质抗菌活性的优劣比较分析。

本发明提供的将几丁质结合域以正确读码框连接到抗真菌蛋白质的N末端进行融合表达与纯化的方法，其步骤如下：

(1)通过PCR或其它手段，得到抗真菌蛋白质的开放阅读框序列，克隆到适当的表达载体中，然后将几丁质结合域的编码序列再次插入到该载体中，与抗真菌蛋白质的读码框相融合，注意间隔适当核苷酸以保证酶切位点及阅读框的正确；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入大肠杆菌，得到的基因工程菌接种于LB液体培养基中，培养到对数生长期后以IPTG诱导蛋白质的表达，然后超声破菌，获得总的菌体蛋白质；

(3)利用载体所带的蛋白质表达标签的亲和介质纯化步骤(2)所得蛋白质，透析，获得纯化了的带有几丁质结合域的抗真菌蛋白质。

应注意到，除了利用基因工程手段生产目的蛋白质外，操作者还可以将抗菌蛋白质的阅读框与CBD编码序列融合后插入到转基因载体中，然后转化目的物种，以产生抗病能力更强的新物种。

本发明还提供测试改造过的融合蛋白质与几丁质的结合能力的方法，其步骤为：将表达了融合蛋白质的大肠杆菌总蛋白与几丁质珠(市售)温育，洗去非特异性结合的蛋白质，收集亲和柱上样流出液并进行SDS-PAGE电泳，通过检验各上样流出液中是否含有目的融合蛋白及目的融合蛋白的量来判断目的融合蛋白的几丁质结合能力。