[发明专利]调味品中大肠菌群的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及菌群的检测，特别涉及一种调味品中大肠菌群的快速检测方法。

背景技术

在食品行业，大肠菌群的含量是一项重要的卫生指标。目前传统国家标准方法(GB)采用9管发酵，48-72小时才可以出结果，存在滞后现象、检测效率低。改进后的方法如：荧光方法(SN)、显色培养基方法，膜过滤方法，这几种方法24-48小时可以出结果，仍不能达到快速检测的目的。另外，免疫学方法，虽然8小时可以出结果，但检出限有限，同时检测成本高，一旦菌体发生变异，检测结果就不准确；分子生物学方法，虽然12小时可以出结果，明显提高了检测灵敏度，但是该方法检测成本较贵、操作繁杂、对操作员的技术要求高，不利于推广。

因此，开发适宜生产需要、操作简单的快速大肠菌群检测方法十分必要。在所有方法中利用β-半乳糖苷酶作为标记物检测大肠菌具有较好的应用潜力。可以保证建立的快速检测方法具有操作简单、低成本等优点，同时该方法也存在很大的挑战，如何达到国家标准方法的检出限，如何降低检出所消耗的时间，提高检出速率等。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种调味品中大肠菌群的快速检测方法，利用β-半乳糖苷酶作为标记物检测调味品中的大肠菌群，能以较高的检出速率达到国家标准方法的检出限。

为解决以上技术问题，本发明的技术方案是，一种调味品中大肠菌群的快速检测方法，包括如下步骤：

1)将样品利用无菌生理盐水稀释5～40倍，加入助滤剂，用真空过滤法滤过一级滤膜，取滤后液过二级滤膜，再利用20～50ml无菌生理盐水洗涤，菌体截留在二级滤膜上；

2)将菌体置入增菌增酶培养液中，对菌体进行修复、增菌增酶培养；

3)在培养后的菌体悬液中加入包含发光试剂底物、大肠菌群温和裂解液、发光增强剂的发光检测试剂进行发光值检测，根据发光值判断大肠菌群数量；

所述增菌增酶培养液包括以体积比100∶1混合的组分A、组分B，组分A为：每1000ml蒸馏水中含有胰蛋白胨0.5～2g，氯化钠2～5g，磷酸二氢钾6～8g，氢氧化钠1～2g，组分B为：每100mL蒸馏水中含有β-半乳糖苷酶诱导物0.05-0.2g，亚致死细菌快速修复物3-6g，细菌快速增长剂2-5g。

其中，步骤1)中，所述一级滤膜为30μm聚丙烯滤膜，所述二级滤膜为0.2-0.45μm混合醋酸纤维素滤膜。

其中，大肠菌群的培养条件为：将分离的菌体悬浮于增菌增酶培养液中于39℃～42℃的恒温培养箱中培养6～7小时。

其中，组分A在121℃灭菌15分钟后再与组分B混合。

其中，步骤3)中的发光值检测为：将50μl～100μl的增菌增酶培养后的菌体悬液与50～100μl发光检测试剂反应10～50分钟，利用发光光度计于530nm～590nm处检测发光值，将检样发光值与阴性对照样发光值比对。

其中，所述β-半乳糖苷酶诱导物为乳糖、异丙基硫代半乳糖苷或者半乳糖中的任一种。

其中，所述亚致死细菌快速修复物为甘油、葡萄糖、丙酮酸钠、抗坏血酸、维生素E中的任一种或多种。

其中，所述细菌快速增长剂为三磷酸腺苷、肌酐，肌苷或者牛血清提取物中的任一种或多种。

其中，组分A中，每1000ml蒸馏水还包括自由基清除剂1g～3g、十二烷基磺酸钠0.03g～0.06g。

其中，所述自由基清除剂为活性炭、可溶性淀粉、半胱氨酸、二苯胺、巯基乙醇或α-生育酚中的任一种。

其中，所述大肠菌温和裂解液为细胞膜破坏试剂，所述细胞膜破坏剂为EDTA、Nisin、Tween-80、硫酸粘菌素B、曲拉通、CATB中的任一种。

其中，所述发光试剂底物为AMPGD、铕试剂、荧光素-β-半乳糖苷中的任一种。

其中，所述发光增强剂为季铵盐高聚物。

其中，所述助滤剂为吐温-60或吐温-80。

本发明的检测方法具有如下优点：

本发明针对蚝油、黄豆酱等调味品成分复杂特点，利用菌体分离富集技术收集菌体，去除干扰菌体生理状态、影响β-半乳糖苷酶与检测用酶底物反应的物质；通过高效增菌增酶培养液对菌体悬液进行培育，使快速增菌的同时增加β-半乳糖苷酶的量；检测时，所用发光检测试剂，通过添加大肠菌温和裂解液使β-半乳糖苷酶(胞内酶)释放到培养液中，提高酶的得率和活力；通过选用好的检测用发光试剂底物及添加发光增强剂，提高检出速率和提高灵敏度。本发明检测方法速度快，8小时内即可准确检出大肠菌群存在与否，远快于国家标准方法(48-72小时)，而且检测成本低廉，检测成本为3元/样品。

附图说明