[发明专利]红毛藻藻红蛋白分离纯化的方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种藻红蛋白的提取方法，特别是涉及一种红毛藻中藻红蛋白的分离纯化方法。

背景技术

藻红蛋白是许多海藻的重要捕光色素蛋白，它与藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白等藻胆蛋白组成棒状的藻胆体，藻胆体能够捕获和传递光能。藻红蛋白主要分布在海藻的红藻中，由于色素分子的存在，它在可见光区480-570nm波段有较强的吸收，且可产生强烈的荧光。藻红蛋白可以作为天然色素应用于食品、化妆品、染料等行业，还可制成荧光试剂，用于临床医学诊断和免疫化学及生物工程等研究领域。藻红蛋白还是一种重要的生理活性物质，可制成光敏剂应用于肿瘤光动力学治疗。目前，藻红蛋白的分离纯化主要采用硫酸铵分级沉淀，离子交换柱层析，羟基磷灰石柱层析，凝胶过滤层析相结合的方法进行，分离纯化过程繁琐，操作复杂，耗时长，且成本高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺简单，分离效果好的红毛藻中藻红蛋白的分离纯化方法。

本发明的工艺流程设计原理是：在离子交换层析中，藻红蛋白对阴离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷基团的静电吸引，而这种吸引力与溶液的pH值及盐浓度有关，因为pH值决定阴离子交换剂和蛋白质的电离程度，当pH值接近藻红蛋白的等电点(pI约为3.8)时，阴离子交换剂和蛋白质的相互作用减弱，蛋白质容易被洗脱下来；同时溶液中盐浓度的微小变化也会直接影响阴离子交换剂对蛋白质电荷的吸附容量。故本发明采用盐浓度线性梯度洗脱和pH值线性梯度洗脱相结合的洗脱方式对藻红蛋白进行纯化。

本发明的具体步骤：

1、提取：将红毛藻以1∶20-25(m/v)比例溶于蒸馏水中，经过冻结-融解、搅拌、组织捣碎、超声波破碎后，过滤、离心，上清液为粗提液。

2、盐析：在粗提液中加入一定量的硫酸铵，使得溶液达到35％硫酸铵饱和度，静置2小时，离心后弃沉淀。在上清液中加入硫酸铵至50％饱和度，静置2小时，离心后弃上清液，用0.02mol/L磷酸缓冲液(pH＝7.0)溶解沉淀，得盐析液。用30kDa分子量截留的超滤膜浓缩脱盐并去除分子量小于30kDa的杂蛋白。浓缩过程中适量加入磷酸缓冲液确保脱盐完全。

3、吸附分离：将脱盐后的藻红蛋白母液泵入填装有功能团为三乙基胺或四甲基胺的阴离子交换树脂吸附柱中，控制流速为1mL/min，吸附完毕后，用0.02mol/L磷酸缓冲液(pH＝5.6，含0.05mol/L NaCl)充分冲洗柱子至280nm下的吸光度到基线。

4、解吸：吸附完成后的树脂经由相同体积的0.02mol/L磷酸缓冲液(pH＝5.6，含0.05mol/L NaCl)和0.2mol/L NaH₂PO₄溶液(含0.2mol/L NaCl)混合组成的线性梯度洗脱液淋洗解吸，收集洗脱液，多数洗脱液组分中藻红蛋白纯度(A₅₆₅/A₂₈₀)高于3.2，藻红蛋白得率约为0.8g/100g红毛藻。

5、树脂再生：解吸后，树脂先用2mol/L NaCl溶液淋洗4小时，再将树脂拆下，在0.1mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小时，然后用大量蒸馏水清洗树脂至近中性，树脂再生完毕，可循环使用。

本发明通过进行具体的硫酸铵分级沉淀实验，获得最适合分离纯化红毛藻中藻红蛋白的硫酸铵分级沉淀饱和度(35％-50％)；解吸阴离子交换树脂时，通过使用混合梯度洗脱方式，即盐浓度线性梯度洗脱和pH值线性梯度洗脱相结合的方式，获得纯度大于3.2和得率为0.8％(相对于红毛藻干重)的藻红蛋白。

本发明在硫酸铵盐析后，利用藻红蛋白分子量大(240kDa)的特点，采用30kDa分子量截留的超滤膜浓缩脱盐。与耗时较长的透析脱盐相比，膜浓缩在实现快速脱盐的同时减少了样品体积，节省了离子交换柱的上样时间；去除了分子量小于30kDa的杂蛋白，显著提高了纯化效率。

由于本发明利用阴离子交换树脂快速有效分离纯化红毛藻中的藻红蛋白，因而具有工艺简单，分离效果好的优点，大大简化了原来需要进行多次柱层析的纯化步骤。