[发明专利]制备5’-磷酸二酯酶的方法及用其制备2’-脱氧核苷酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从麦芽根中制备高活力液体5’-磷酸二酯酶的方法，以及应用该酶降解脱氧核糖核酸制备高纯度2’-脱氧核苷酸的方法。

背景技术

2’-脱氧核苷酸为组成遗传物质脱氧核糖核酸(DNA)的重要组成部分，参与细胞内大量的生化反应。临床上，2’-脱氧核苷酸的混合钠盐可制备为针剂或口服剂，用于辅助治疗免疫低下的患者。近年来随着分子生物学的高速发展，尤其是现代基因工程技术中大量使用脱氧核苷三磷酸作为PCR的基础试剂，作为合成脱氧核苷三磷酸的原料-2’-脱氧核苷酸的市场需求日益增加。

目前，2’-脱氧核苷酸的制备主要由酶法降解DNA中获得，其工艺大体如下：1)利用市售的5’-磷酸二酯酶或桔青霉发酵产生的核酸酶P1，降解由鱼白中提取的DNA，获得酶解液，即2’-脱氧腺苷酸(dAMP)、2’-脱氧胞苷酸(dCMP)，2’-脱氧鸟苷酸(dGMP)和胸苷酸(TMP)的混合物；2)经活性炭脱盐、脱蛋白进行纯化；3)浓缩干燥后得到混合2’-脱氧核苷酸的固体。

上述工艺对于制备混合2’-脱氧核苷酸具有一定的意义，但是对于应用到分子生物学试剂却没有实际作用。因为分子生物学试剂需要极高的纯度(HPLC纯度至少要达到98％以上)，以满足后期的试验需要。

有关从麦芽根中提取5’-磷酸二酯酶用于降解核糖核酸(RNA)制备核苷酸已有不少报道，如中国专利公开号CN101012469A提供了一种采用液体5’-磷酸二酯酶制备5’-核苷酸类物质的方法；李德莹等报道了从麦芽根中提取5’-磷酸二酯酶降解生产5’-核苷酸的方法(华东理工大学学报，2002，28(4)：376-379)。这些报道中均未提及脱氧核糖核酸的酶解。

有关从核糖核酸的降解液中提取核苷酸的方法也很多。如中国专利公开号CN1286259公开了一种使用阳离子树脂分离5’-核苷酸的方法；中国专利ZL02136839.2公开了一种使用阴离子树脂分离5’-核苷酸的方法；中国专利公开号CN101381382A中提供了一种使用阴离子树脂分离2’-脱氧核苷酸的方法。上述方法中大多是以分离5’-核苷酸为目的，或以制备混合2’-脱氧核苷酸为目的。

Makoto等使用桔青霉发酵得到的核酸酶P1，大约有47％的DNA降解为2’-脱氧核苷酸(Food research International，1996，29(8)∶751-755)；吴汉民等亦以同样的方法降解DNA，并用阴离子交换树脂分离法分离得到了2’-脱氧核苷酸，报道中未提到转化率及2’-脱氧核苷酸的收率(水产学报，2000，24(3)：275-279)。

上述专利和文献中所述及的方法，2’-脱氧核苷酸的转化率低、或分离工艺效率低下、或未涉及高纯度2’-脱氧核苷酸的制备。

发明内容

本发明的发明人经过广泛的探索，发明了一种从麦芽根中制备高活力液体5’-磷酸二酯酶的方法。然后发明了应用该酶降解脱氧核糖核酸制备2’-脱氧核苷酸的方法。

因此，本发明所要解决的技术问题之一是提供一种从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法。

本发明所要解决的技术问题之二是提供一种用从麦芽根中制备的5’-磷酸二酯酶降解DNA生产2’-脱氧核苷酸，并从酶解液中分离得到高纯度的2’-脱氧核苷酸的方法，以解决现有技术中存在的2’-脱氧核苷酸的转化率低、或分离工艺效率低下、或未涉及高纯度2’-脱氧核苷酸的制备之类的技术缺陷。

本发明的从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法包括如下步骤，(1)浸泡：将粉碎或未粉碎的麦芽根与去离子水混合、浸泡，浸泡温度10-50℃、浸泡时间1-8小时；(2)固液分离：浸泡结束后，过滤或离心，收集清液；(3)清液中加入0.1-0.5倍的有机溶剂，并搅拌1-8小时，于1000-10000转/min离心去除残渣，收集离心液；(4)向离心液中加入0.5-20倍离心液体积的有机溶剂，于室温下静置1-24h后，虹吸去除上层的液体，下层的液体搅匀即为高纯度液体5’-磷酸二酯酶。

优选的从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法，其中浸泡温度40-45℃，浸泡时间为3-5小时。

更优选的从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法其中步骤(1)去离子水用量为麦芽根重量的7-8倍。

所用麦芽根为大麦或燕麦发芽后的根，也可以为各种植物的根尖部分。优选为啤酒工业中废弃的麦芽根。麦芽根可浸泡后再进行粉碎，也可以粉碎后再浸泡。本发明优选粉碎后再浸泡，粉碎的粒度可在50-400目之间，优选为250目-350目。