[发明专利]制备5’-磷酸二酯酶的方法及用其制备2’-脱氧核苷酸的方法

权利要求书

1.从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于包括如下步骤，(1)浸泡：将粉碎或未粉碎的麦芽根与去离子水混合、浸泡，浸泡温度10-50℃、浸泡时间1-8小时；(2)固液分离：浸泡结束后，过滤或离心，收集清液；(3)清液中加入0.1-0.5倍的有机溶剂，并搅拌1-8小时，于1000-10000转/min离心去除残渣，收集离心液；(4)向离心液中加入0.5-20倍离心液体积的有机溶剂，于室温下静置1-24h后，虹吸去除上层的液体，下层的液体搅匀即为高纯度液体5’-磷酸二酯酶。

2.根据权利要求1的从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于，步骤(1)的，加入的酶活为500U-3000U/g DNA，优选为1000U-2500U/g DNA，搅匀后于60-65℃反应1-24h得酶反应液，(3)2’-脱氧核苷酸的分离纯化：上述酶反应液2.0L用氢氧化钠调pH至8.0左右，通过装有250mL的阴离子交换树脂的玻璃柱(Φ2.6cm×70cm)，流速控制在100-200mL/h，上样结束后，依次用下列溶液进行洗涤或洗脱：2500mL氢氧化钠溶液(pH＝8.0)、1500mL 0.01mo浸泡温度40-45℃，浸泡时间为3-5小时。

3.根据权利要求1的从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于，步骤(1)去离子水用量为麦芽根重量的7-8倍。

4.根据权利要求1的从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于，步骤(3)和(4)的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、二氢呋喃、二甲基亚砜。

5.制备2’-脱氧核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤，(1)根据权利要求1的从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶；(2)酶解DNA：配制0.5％-5％(W/V)DNA溶液，加热到25-75℃，然后加入上述制备的5’-磷酸二酯酶1/L甲酸(I)、1500mL 0.15mol/L甲酸(II)、2000mL 0.01mol/L甲酸-0.05mol/L甲酸钠(III)、2000mL 0.1mol/L甲酸-0.2mol/L氯化钠(IV)，将I-IV洗脱下来的四种2’-脱氧核苷酸溶液用氢氧化钠调pH8.0-pH10.0，分别用100mL的阴离子交换树脂进行吸附(Φ1.6cm×70cm)，流速控制在50-100mL/h，上样结束后，用100mL去离子水洗涤树脂柱，弃去洗涤液，最后用150mL 0.1mol/L甲酸-0.5mol/L氯化钠(V)分别从四根柱上洗脱下来2’-脱氧核苷酸，收集洗脱液，浓缩至10-50mL，加入3-10倍体积的乙醇沉淀出2’-脱氧核苷酸，经过滤、抽干、烘干，分别得到2’-脱氧胞苷酸、2’-脱氧腺苷酸、胸苷酸二钠、2’-脱氧鸟苷酸二钠。

6.根据权利要求5的制备2’-脱氧核苷酸的方法，其特征在于，步骤(2)酶解DNA：配制1％-3％(W/V)DNA溶液，加热到60-65℃，然后加入上述制备的5’-磷酸二酯酶溶液，加入的酶活为1000U-2500U/g DNA，搅匀后于60-65℃反应7-10h得酶反应液。