[发明专利]一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及薇藻细胞的培养领域，具体涉及一种两阶段高效生产发菜细胞及其胞外多糖的方法。

背景技术

发菜(Nostoc flagelliforme)，学名是发状念珠藻，俗称发菜，是一种丝状聚合体陆生蓝细菌(蓝藻)，主要分布于我国西北和华北的荒漠-半荒漠地区。发菜进行光合作用，固定二氧化碳，同时具有固氮能力，可将大气中的分子态氮固定为生物可利用的氮素化合物，是荒漠地区土壤中氮元素的主要来源，能为其它土壤微生物的生长提供碳源和氮源，因此，人们称其为荒漠中的“先锋生物”，在生态脆弱带的能量与物质循环中起着重要作用。

长期以来，发菜作为一种食用蓝细菌，受到广大消费者尤其是闽粤、港澳台及东南亚地区消费者的青睐。发菜对恶劣环境具有极强的适应性，其生长过程中向细胞外分泌大量的胶状物质，包裹于发菜细胞及藻丝外，形成胶质鞘，保护发菜细胞不受干旱、高温、紫外辐射的损伤。胶状物质的主要成分为多糖，发菜多糖是一类酸性杂多糖，初步研究表明，发菜多糖对流感病毒、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等多种具封套的病毒均具有抗病毒活性。发菜多糖能阻断病毒对寄主细胞的吸附，阻止病毒在寄主细胞内的复制，具有直接的抗病毒活性。日本等国对发菜多糖的生理功能进行了多方面的研究，开展了有关药物和保健品的研发工作。

由于发菜具有很高的经济和药用价值，因此，发菜和发菜多糖的需求量不断上升，巨大的市场需求导致过渡采收造成发菜资源濒临枯竭，从保护生态的角度出发，我国政府从2000年7月起就已禁止了对发菜的采收和销售，导致作为一种具有良好应用前景的生物活性物质发菜多糖因原料资源匮乏而难以得到大规模的开发和生产。

为了解决市场需求不足和保护生态环境这一两难问题，人们对人工培养发菜进行了深入的研究，主要包括固态培养法和液体培养法，在不消耗天然发菜资源、不破坏发菜生长地生态环境的情况下扩大发菜的生产，能够基本满足市场需求。

根据检索，发现有以下几篇专利文献与本发明相关，分别是：

1、专利(02138828.8)“一种培养发菜细胞的方法”，该方法提供了一种发菜细胞的培养方法，其特点是从原种发菜匀浆获得匀浆液，经逐步扩大用于发菜细胞培养，为发菜细胞的液体培养提供了一个新的途径，但是该方法只采用发菜藻丝体而非发菜细胞进行光合自养培养，并且没有涉及利用发菜细胞生产胞外多糖。

2、专利(CN12144690C)“一种发菜细胞培养联产发菜多糖的方法”，该方法从野生发菜藻体中分离获得离体细胞，将分离得到的发菜细胞作为种子进行长期保藏，用于发菜细胞进一步培养，从培养液中提取发菜多糖或直接作为功能性食品、药物的生产胞外多糖方法。该方法与野生发菜相比，生长速度有了较大的提高，该方法改变了只能从发菜藻体中提取发菜多糖的现状，但由于该方法采用光合自养培养方法，在培养的后期受到光衰减的影响，使最终收获的发菜细胞量和胞外多糖的产量都较低。

3、专利(200510122059.9)“发菜细胞的固态培养方法”，并在日本申请两项专利：“髪菜細胞の培餋と髪菜多糖の抽出をリンクさせて行ぅたぬの方法(C12N1/12PF5483)、髪菜細胞の固体培餋方法(C12N1/12PF5482)”，该方法是将液体悬浮培养获得的发菜细胞培养物接种于固态培养基中，在人工或自然条件下培养发菜细胞，并进行干湿节律培养，提供可控的适宜培养条件，实现完全人工培养或野外扩大培养，该方法突破了传统培养方式，加快了生产速度，但该方法还不能实现发菜的人工种植产业化生产。

4、专利(200610013589.4)“稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养方法”提供了一种发菜细胞高密度培养的方法，采用混合营养和异养培养的模式，能在较短的时间内获得大量发菜细胞和胞外多糖，该方法突破了传统的发菜细胞生长的光合自养培养模式，减少了培养过程中对光的依赖性，通过添加有机碳源可以提高发菜细胞的生长速度，缩短了发菜细胞的培养周期，同时可以提高发菜多糖的产量，但由于该培养方法在培养开始时就在培养基中添加了葡萄糖，极易染菌，使培养过程中对无菌生产条件要求非常严格，从而大大提高了生产成本和生产的风险性，不利于发菜细胞及其胞外多糖的工业化生产。

目前文献报道的发菜培养方法都是采用单一阶段方式培养，包括光合自养、混合营养和异养培养，光合自养培养法存在对光照的依赖性、细胞生长速度慢、细胞密度低、胞外多糖产量低等缺点，混合营养和异养培养存在原料利用率低、容易污染杂菌、无菌条件要求高、风险性高、生产成本高等缺点。

发明内容