[发明专利]一种鉴别番茄耐盐性状的分子标记方法

说明书

技术领域

本发明涉及番茄耐盐主效基因定位，DNA提取，PCR的扩增，在已有的RFLP标记信息基础上设计PCR引物和限制性内切酶，把操作复杂、成本较高的RFLP标记转化为操作简单、成本适宜的CAPS标记，鉴别其该物种的耐盐的性状。

背景技术

盐分是限制植物生长和产量的主要环境因素之一，土壤盐渍化是一个世界性问题，其中由于过量施用化肥，造成土壤尤其是蔬菜保护地次生盐渍化已是一个极其严重的现象，常障碍蔬菜作物的生长、发育，导致大幅度减产，产品品质下降。作物耐盐新品种的选育，一直是国内外研究的重点，番茄(Lycopersicon esculentum Mill)是茄科番茄属的一年生草本植物，属中度盐敏感型鲜食和加工型蔬菜作物，其在高盐土壤上生育状况差。

国内外对番茄的耐盐性进行了广泛的研究。因此，为了丰富我国番茄品种的遗传资源，改良番茄的耐盐性，选育耐盐性强、品味好的品种一直是番茄育种的重要目标。对番茄进行耐盐性研究和耐盐基因的转化研究，也可为进一步研究其它双子叶植物的耐盐机制和耐盐基因的转化奠定基础。目前番茄主要是以育苗移栽为主，因此番茄苗期耐盐就显的尤为重要，部分野生资源材料及个别栽培种表现出一定程度的耐盐性，为番茄耐盐育种提供了可能。

利用分子标记及生物工程技术深入挖掘这些材料，可加速番茄耐盐遗传改良。经专利文献检索披露：号为CN200910020964.1的《一种鉴别辣椒抗疫病性状的分子标记方法》专利；号为CN200810197310.1的《一种与番茄抗病性状相关的分子标记克隆剂应用》专利；号为CN200510010485.3的《一种鲤鱼抗寒性状的分子标记鉴定技术》的专利都涉及了PCR分子标记的研究，方法都比较复杂。

本研究发明采用简单易操作的PCR分子标记，可快速检测番茄的耐盐材料与盐敏感材料，为利用分子标记辅助选育和基因工程等手段改良番茄耐盐新品种提供了基础，极大地加速了番茄耐盐育种进程。

发明内容

本发明的目在于：获得的PCR标记，可快速检测番茄苗期耐盐基因，且不受生长期，外界环境等的影响，是一种快速鉴定和评价番茄苗期耐盐材料的方法。

本发明的目的是这样实现的：一种鉴别番茄耐盐性状的分子标记方法，包括以下步骤：1)耐盐主效基因定位；2)人工设计合成一对核苷酸序列作为引物，该引物是由碱基组成的特定序列的寡聚体，其中：正向引物：5’GCCAATCCAAACAAACCA’3，反向引物：5’CATTGTCTCCTTCGCCTCG’3；3)提取番茄基因组DNA，以此对引物将番茄基因组DNA进行PCR扩增，无需特异性内切酶酶切，就可得到有差异性的产物条带，利用此引物对的差异性产物条带就可鉴别出番茄耐盐材料和盐敏感材料；4)PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录，耐盐材料PCR产物有1000bp的1条谱带，盐敏感材料有900bp的1条谱带。

所述的分子标记方法，利用番茄野生资源S.pennellii LA716的76个渐渗系材料，通过耐盐筛选，将7个耐盐主效基因定位在番茄的5条染色体上，研究所用的渐渗系材料IL7-5-5的片断上含有其中一个耐盐主效基因。

所述的分子标记方法，以CTAB法提取7-8片真叶时幼苗的DNA，用0.1×TE稀释后贮存于-20℃的冰箱中备用。

所述的分子标记方法，CAPS体系的建立采用50ng模板DNA，1.25UTaqDNA聚合酶，Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L，dNTP浓度为0.25mmol/L，每个引物浓度为0.2umol/L，最终体积为25ul的PCR体系。

所述的分子标记方法，PCR反应在MJ PTC-200热循环仪上进行，反应程序为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共37个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

所述的分子标记方法，对引物的退火温度进行优化筛选，分别设55℃、58℃和60℃的温度梯度，比较结果。

所述的分子标记方法，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用1.5％的琼脂糖凝胶(0.5×TBE缓冲液)，每样品加5ul PCR产物，3ul上样缓冲液，溴化乙锭染色，在Gel doc 1000凝胶成像系统下检测PCR产物，如果PCR扩增产物与预期结果一致，进一步将PCR产物用限制性内切酶消化。