[发明专利]一种鉴别番茄耐盐性状的分子标记方法

权利要求书

1.一种鉴别番茄耐盐性状的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：1)耐盐主效基因定位；2)人工设计合成一对核苷酸序列作为引物，该引物是由碱基组成的特定序列的寡聚体，其中：正向引物：5’GCCAATCCAAACAAACCA’3，反向引物：5’CATTGTCTCCTTCGCCTCG’3；3)提取番茄基因组DNA，以此对引物将番茄基因组DNA进行PCR扩增，无需特异性内切酶酶切，就可得到有差异性的产物条带，利用此引物对的差异性产物条带就可鉴别出番茄耐盐材料和盐敏感材料；4)PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录，耐盐材料PCR产物有1000bp的1条谱带，盐敏感材料有900bp的1条谱带。

2.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：利用番茄野生资源S.pennellii LA716的76个渐渗系材料，通过耐盐筛选，将7个耐盐主效基因定位在番茄的5条染色体上，研究所用的渐渗系材料IL7-5-5的片断上含有其中一个耐盐主效基因。

3.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：以CTAB法提取7-8片真叶时幼苗的DNA，用0.1x TE稀释后贮存于-20℃的冰箱中备用。

4.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：CAPS体系的建立采用50ng模板DNA，1.25UTaqDNA聚合酶，Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L，dNTP浓度为0.25mmol/L，每个引物浓度为0.2umol/L，最终体积为25ul的PCR体系。

5.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：PCR反应在MJ PTC-200热循环仪上进行，反应程序为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共37个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

6.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：对引物的退火温度进行优化筛选，分别设55℃、58℃和60℃的温度梯度，比较结果。

7.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用1.5％的琼脂糖凝胶(0.5×TBE缓冲液)，每样品加5ul PCR产物，3ul上样缓冲液，溴化乙锭染色，在Gel doc 1000凝胶成像系统下检测PCR产物，如果PCR扩增产物与预期结果一致，进一步将PCR产物用限制性内切酶消化。

8.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：研究所用的限制性内切酶，除Taq I的限制性酶切反应温度为65℃外，其余的限制性内切酶酶切反应温度均为37℃，反应时间为4小时以上。

9.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：限制性内切酶反应体系为：1.5ul限制性内切酶缓冲液，0.2ul限制性内切酶，3.3ul ddH₂O，10ul PCR产物。

10.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：1.5％琼脂糖凝胶电泳酶切产物，每样品加8ul酶切产物，3ul上样缓冲液，溴化乙锭染色，在Gel doc 1000凝胶成像系统下检测酶切产物。

11.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：研究所用的RFLP标记的序列来源于Cornell大学，所有用作CAPS分析的引物，由上海生物技术工程服务有限公司合成，CAPS标记的名称仍用原来的RFLP标记的名称。