[发明专利]钝齿棒杆菌N-乙酰谷氨酸激酶突变提高精氨酸产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及工业微生物生产，具体涉及产生精氨酸的方法。更具体的，本发明涉及精氨酸生产关键酶——N-乙酰谷氨酸激酶的用途，对其进行改造，是一种新的突变N-乙酰谷氨酸激酶和一种含有该酶的基因工程重组钝齿棒杆菌生产精氨酸的方法。

背景技术

L-精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸，是合成蛋白质肌酸的重要原料，也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物，具有多种独特的生理和药理作用。L-精氨酸在临床医药、食品、化妆品以及有关生物研究领域中用途广泛。发酵法是目前L-精氨酸商业化生产比较有效和经济的方法。

在原核微生物中，合成精氨酸的途径有线性途径和循环途径两种。线性途径中的L-精氨酸的合成是从谷氨酸开始，经历了8种酶催化而成。首先，谷氨酸的氨基基团在由argA基因编码的乙酰谷氨酸合成酶的作用下乙酰化，乙酰化作用既阻止了自发环化又阻止了谷氨酸羧基基团被修饰形成脯氨酸。此途径的第5步是乙酰鸟氨酸在酶的作用下脱去乙酰基团形成鸟氨酸，即乙酰鸟氨酸在由argE基因编码的乙酰鸟氨酸酶的水解作用下形成精氨酸前体物——鸟氨酸。因此根据脱乙酰基团方式的不同，L-精氨酸的另一种合成途径为循环途径，即乙酰鸟氨酸在由argJ基因编码的鸟氨酸乙酰转移酶的作用下形成鸟氨酸的同时，乙酰基团被转移至谷氨酸形成乙酰谷氨酸，在此途径中，鸟氨酸乙酰转移酶表现出二重功能—既具有乙酰鸟氨酸酶的功能又具有乙酰谷氨酸合成酶的功能，故此途径又称为经济循环途径肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞铜绿菌(Pseudomonas aeruginosa)及古细菌中的硫化裂片菌(Sulfolobussolf ataricus)以线形途径生产精氨酸，而迄今研究过的所有其他原核微生物，包括嗜温性古细菌、杆状脂肪嗜热菌(Bacillus stearothermophilus)、奈瑟氏淋球菌(Neisseriagonorrboeae)及杆菌属，以及真核微生物都采用循环途径。有报道表明，在肠杆菌中，合成精氨酸的第1个酶——乙酰谷氨酸合成酶是终产物精氨酸反馈抑制的靶目标；而采用循环途径的微生物，被精氨酸抑制的关键酶是合成途径的第2个酶——乙酰谷氨酸激酶或第5个酶——鸟氨酸乙酰转移酶。谷氨酸棒杆菌中被精氨酸抑制的关键酶是乙酰谷氨酸激酶，此酶不仅被精氨酸反馈抑制亦被其反馈阻遏。

随着我国医药营养水平的提高，对精氨酸的需求日益增长，但传统生产L-精氨酸的高产菌株大多采用诱变筛选的方法获得，但此法有盲目性高、工作量大，且存在突变株生理失调、易退化等局限性；DNA重组技术出现以后，人们开始探索利用DNA重组技术调控合成精氨酸代谢途径，以达到提高精氨酸产量的目的。钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)是我国研究者分离到的一种钝齿状、无芽孢的革兰式阳性菌，其突变株在国内氨基酸生产中被广泛应用，但对其遗传背景的研究还处于空白状态。C.crenatum SYPA5-5是本实验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株。C.crenatum利用循环途径合成精氨酸，乙酰谷氨酸激酶(NAGK)等是合成途径中的关键酶，经证明此酶受到产物精氨酸的反馈抑制和反馈阻遏。

利用代谢工程提高L-精氨酸产量最重要的策略之一就是提高关键酶酶量，借助于基因克隆与表达技术，通过理性蛋白质设计和定点突变等技术对精氨酸生产途径中关键酶N-乙酰谷氨酸激酶进行改造，从而获得解除产物精氨酸反馈抑制作用的N-乙酰谷氨酸激酶，将其突变基因导入生产菌中，从而增强菌体内酶促反应的强度，强化表达，达到提高精氨酸产量的目的。

发明内容

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是革兰氏阳性生产L-精氨酸的工业用菌株，本发明涉及在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中构建在精氨酸的生物合成中起关键作用的突变的和高活性及抗精氨酸反馈抑制的N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)。

在本发明中，提出来用argB基因中编码天冬氨酸残基的GAT密码子取代编码NAGK蛋白中287位的甘氨酸的GGA密码子。氨基酸序列中氨基酸残基的取代导致了具有天然活性水平的突变蛋白的表达。发现上述突变NAGK变得对精氨酸的反馈抑制作用明显降低。然后本发明人发现用具有突变的argB^SD基因的DNA转化的钝齿棒杆菌产精氨酸能力提高，因此完成了本发明。

本发明提供了以下内容：