[发明专利]基于单分子计数的肿瘤相关蛋白的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及基于单分子计数的肿瘤相关蛋白的检测方法。

背景技术

癌症在我国是导致居民死亡的首要因素。癌症的早期发现和早期干预能有效地提高癌症治愈率。在癌症早期，以肿瘤相关蛋白为代表的肿瘤标志物可作为癌症诊断的重要指标。因此，发展超灵敏，超低检测限的蛋白质分析检测方法是实现肿瘤标志物的超灵敏检测的必然要求。它对肿瘤的早期发现及其它重要疾病的早期诊断具有重要意义，同时也是生化分析领域当前的热点研究方向。

以酶联免疫吸附实验(ELISA)为代表的蛋白检测方法是目前市场上最常见的蛋白检测技术之一，虽然操作方便，但是普遍存在灵敏度不高，检测限偏高的问题，难以实现肿瘤相关蛋白的超低浓度检测；同时利用生物酶放大信号，有可能产生假阳性反应，影响检测的真实性。因此，有必要发展新型、简便、无需采用生物酶信号放大、超灵敏的蛋白分析检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肿瘤相关蛋白的检测方法。

本发明提供的肿瘤相关蛋白的检测方法，包括如下步骤：

1)将待检测的肿瘤相关蛋白分子通过配体和受体的特异性相互作用、或者抗体和抗原的特异性相互作用捕获于玻璃片上，然后往所述玻璃片上加入经荧光标记的针对所述待检测的肿瘤相关蛋白分子的抗体，得到待检测的玻璃片；

2)将步骤1)得到的待检测的玻璃片置于全内反射显微镜的物镜上，进行肿瘤相关蛋白的检测。

在一个实施例中，上述待检测的肿瘤相关蛋白分子可以是血小板源性生长因子β受体(PDGFRβ)；具体可以是血小板源性生长因子β受体Fc嵌合体(PDGFRβ FcChimera)。

进一步，上述步骤1)中，所述待检测的玻璃片的制备方法包括如下步骤：

a)将牛血清蛋白BSA吸附在玻璃片上；

b)在步骤a)的基础上往所述玻璃片上加入戊二醛，使得所述戊二醛与所述牛血清蛋白BSA交联；

c)在步骤b)的基础上往所述玻璃片上加入血小板源性生长因子-DD(PDGF-DD)，使得所述血小板源性生长因子-DD与所述戊二醛相交联；

d)在步骤c)的基础上往所述玻璃片上加入所述血小板源性生长因子β受体；

e)在步骤d)的基础上往所述玻璃片上加入经荧光标记的针对所述血小板源性生长因子β受体的抗体，得到待检测的玻璃片。

上述针对所述血小板源性生长因子β受体的抗体是可商业化途径得到的多克隆抗体。

上述针对所述血小板源性生长因子β受体的抗体也可以是单克隆抗体，所述单克隆抗体的获得方法是如下I)或II)

I)商业化途径得到；

II)体外培养分泌的针对所述血小板源性生长因子β受体的抗体的杂交瘤细胞得到。

具体地讲，上述针对所述血小板源性生长因子β受体的抗体是鼠源单克隆抗体，具体是藻红蛋白标记的抗人的血小板源性生长因子β受体(Anti-human PDGFRβ-Phycoerythrin)。

上述玻璃片在步骤1)之前是经过清洗干净并经N2吹干的。

采用以上技术方案，本发明中首先通过分子间相互作用：配体和受体的特异性结合或抗原和抗体的特异性结合，将待测蛋白捕获于玻璃片表面，然后利用物镜型全内反射成像技术和荧光物质标记的抗体检测蛋白，通过计算荧光亮点的数目来实现肿瘤相关蛋白的较高灵敏度的检测。

本发明属于蛋白质检测方法，与同类技术相比具有操作简便，检测灵敏度高，样品使用量小，无需酶放大等优势，可以检测低浓度蛋白质分子。

附图说明

图1物镜型全内反射成像光路图。

图2待测蛋白捕获示意图。

图3无待测物时的空白图像。

图4PDGFRβ蛋白浓度为10nM时的荧光图像。

图5不同浓度下单分子荧光点计数与PDGFRβ蛋白浓度之间的线性关系。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、

一、全内反射显微镜