[发明专利]一种检测克伦特罗的免疫试剂盒及其专用抗体

权利要求书

1.一种单链抗体，由重链可变区、连接重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区依次连接组成，所述重链可变区的氨基酸序列如序列1自N末端起第15-132位氨基酸残基所示，所述轻链可变区的的氨基酸序列如序列1自N末端起第148-266位氨基酸残基所示。

2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特征在于：所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的氨基酸序列如序列1自N末端起第133-147位氨基酸残基所示。

3.权利要求1或2所述单链抗体的编码基因。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)、2)、3)、4)或5)所示：

1)所述重链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5′末端起第43-396位核苷酸所示的DNA分子；

2)所述轻链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5′末端起第442-798位核苷酸所示的DNA分子；

3)所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的编码基因为自序列表中序列2的5′末端起第397-441位核苷酸所示的DNA分子；

4)序列表中序列2自5′末端起第43-798位核苷酸所示的DNA分子；

5)在严格条件下与1)、2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子。

5.含有权利要求3或4所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系和表达盒。

6.权利要求1或2所述单链抗体在检测克伦特罗或沙丁胺醇中的应用。

7.一种检测盐酸克伦特罗或沙丁胺醇的免疫试剂盒，为下述1)、2)、3)或4)中任一所述试剂盒：

1)试剂盒中包括克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物、权利要求1或2所述单链抗体和酶标记抗抗体；其中，所述偶联物作为包被原；

2)试剂盒中包括克伦特罗半抗原的酶标记物、权利要求1或2所述单链抗体和抗抗体；其中，所述抗抗体作为包被原；

3)试剂盒中包括克伦特罗半抗原的酶标记物、权利要求1或2所述单链抗体；其中，所述权利要求1或2所述单链抗体作为包被原；

4)试剂盒中包括克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物、权利要求1或2所述单链抗体的酶标记物；其中，所述偶联物作为包被原。

8.根据权利要求7所述的免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括克伦特罗标准品溶液、洗涤液和样品浓缩液；所述克伦特罗标准品为盐酸克伦特罗；

所述克伦特罗标准品溶液为如下各浓度的溶液：0ng/L、50ng/L、150ng/L、450ng/L、1350ng/L和4050ng/L；

每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10ml吐温20，5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.005M-0.015M，具体为0.01M，pH值为7.2-7.6，具体为7.4；

所述样品浓缩液为浓度为0.03mol/L-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，具体为0.04mol/L的磷酸盐缓冲液。

9.根据权利要求7或8所述的免疫试剂盒，其特征在于：所述克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物是按照如下方法制备得到的：将每5mg克伦特罗半抗原溶于0.1M盐酸水溶液中，得到克伦特罗半抗原的水溶液，并预冷至0℃；向克伦特罗半抗原的水溶液中加入10mg NaNO₂，4℃条件下搅拌5h，形成溶液Ⅰ；将20mg载体蛋白溶于0.1M磷酸盐缓冲溶液中，得到载体蛋白的溶液；将载体蛋白的溶液加到溶液Ⅰ中，4℃条件下搅拌6h，得到所述克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物；

所述克伦特罗半抗原为盐酸克伦特罗；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白；

所述抗抗体为鼠抗HIS标签单克隆抗体。

10.一种检测盐酸克伦特罗或沙丁胺醇的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用权利要求7-9中任一所述免疫试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述前处理的方法为下述a)、b)、c)和d)中的任一：

a)所述待测样品为猪尿或血清样品；将所述猪尿或血清样品直接作为待测样本溶液，或将所述猪尿或血清样品离心或过滤，取上清液或滤液，得到待测样本溶液；

b)所述待测样品为饲料；将每1g所述待测样品与10mL 0.01M盐酸水溶液混匀，调整pH值至6.5～8，2000r/min离心5min，取100μL上清液；将所述100μL上清液与400μL样品稀释液混匀，即得到待测样本溶液；

c)所述待测样品为液态奶；将每1mL液态奶、2mL蒸馏水和100μL 5M盐酸水溶液混合，在40℃保持3～5min，2000r/min离心5min，取上清液，记作上清液Ⅰ；将所述上清液Ⅰ与100μL 5M氢氧化钠水溶液和6.8mL蒸馏水混合，2000r/min离心15min，取上清液，记作上清液Ⅱ；用400μL样品稀释液稀释所述上清液Ⅱ，得到的溶液即为待测样本溶液；

d)所述待测样品为猪肉或猪肝；将每6g所述待测样品的均质化组织与12mL 3％(质量百分含量)的三氯乙酸水溶液混合，并颠倒混匀30min，10000r/min离心5min或3000r/min离心10min，取上清液；将所述上清液与异丙醇和乙酸乙酯的混合溶液等体积比混合，振荡提取20min，放置2min，10000r/min离心5min或3000r/min离心10min，取3mL上层有机相，氮气吹干，用1mL样品稀释液溶解，得到的溶液即为所述待测样本溶液；所述异丙醇和乙酸乙酯的混合溶液中，异丙醇与乙酸乙酯的体积比为4∶6；

所述样品稀释液为将所述样品浓缩液稀释20倍得到的。