[发明专利]特异序列基础的水通道蛋白4高效价抗体的制备及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及特异序列基础的原核表达GST-AQP4融合蛋白的多克隆抗体及应用。

背景技术

水通道蛋白(aquaporin，AQP)是一类广泛存在于原核和真核生物细胞膜上，选择性高效转运水分子的特异孔道，目前在哺乳类已发现至少12个成员。研究表明，AQP家族在多种组织的液体转运生理和病理中发挥重要作用。水通道AQP4在脑的星形细胞、眼睛、耳朵、骨骼肌、胃腔壁细胞以及肾的集合管等处高表达，并在渗透压驱动的跨内皮水转运中发挥重要作用。

自2003年美国两位科学家因在膜通道研究领域的一些开创性工作而获当年的诺贝尔化学奖以来，水通道蛋白结构与功能的研究已成为热点。对于一种新蛋白质说来，抗体是研究其功能最有力的工具之一。在抗原-抗体相互作用基础上发展起来的一系列技术，如免疫组织化学、免疫印迹和免疫沉淀等，在蛋白质的检测和功能研究中都有着广泛的应用。

水通道蛋白4作为一种跨膜的蛋白分子，其中的疏水片段是无法进行原核表达的，而膜外小的亲水区域无抗原性或抗原性较小。现世面出售的AQP4抗体是以人工合成短肽链作为抗原制备而成，其抗原蛋白的空间结构较AQP4蛋白的空间结构有很大差异。

发明内容

本发明的目的是建立一种能够用于AQP4的检测的模型，为从蛋白水平深入研究AQP4功能及相关疾病提供必要的实验工具。

利用基因工程技术，将小鼠AQP4基因近3′端亲水区克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后，用重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-AQP4融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清。抗血清的效价及特异性采用ELISA和Western blot检测。

本发明的GST-AQP4融合蛋白是将利用特殊序列(小鼠AQP4基因近3′端亲水区)构建GST-AQP4融合蛋白原核表达载体，转化BL21得到的高效表达特异性的GST-AQP4融合蛋白，这段近3′端亲水区基因核苷酸序列为：

781                                  tgtcctgatg tggagctcaa acgtcgcctt

841 aaggaagcct tcagcaaagc cgcgcagcag acaaaaggga gctacatgga ggtggaggac

901 aaccggagcc aagtggagac ggaagacttg atcctg

所表达蛋白的氨基酸序列为：

tkgsymev ednrsqvete dlilkpgvvh vididrgeek kgkd

这种GST-AQP4融合蛋白及其多克隆抗体制备包括以下步骤：

第一步，克隆载体的构建

从小鼠AQP4基因全长上应用PCR技术以p8p64为模板，扩增得到的目的片段与PMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。

第二步，原核表达载体pGEX-4T-1的构建

将克隆质粒和质粒pGEX-4T-1双酶切后，利用回收试剂盒获得AQP4基因该区片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定。

第三步，GST-AQP4融合蛋白的诱导表达和纯化

重组质粒PGEX-4T-1/AQP1转化大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导，GST-AQP4融合蛋白的表达。以SDS-PAGE进行鉴定，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。用超声裂解细菌，所获蛋白用Glutathione-Sepharose 4B柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯化产物。

第四步，兔抗AQP4抗血清的制备，即获得该发明的多克隆抗体

以纯化的AQP4融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500μg融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500μg纯化的GST-AQP4融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于末次免疫后1wk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1∶100 000时，颈动脉放血，收集血清，应用多种免疫学方法检测其效价及特异性。