[发明专利]特异序列基础的水通道蛋白4高效价抗体的制备及应用

权利要求书

1.特异序列基础的原核表达GST-AQP4融合蛋白的多克隆抗体，其特征在于利用特异序列原核表达的GST-AQP4融合蛋白作为抗原免疫动物产生抗血清而获得，该抗血清中抗GST-AQP4抗体的滴度高达1∶50000，并经过Western blot和免疫组化鉴定抗GST-AQP4血清具有较好的特异性，其中，所述的特异序列是指AQP4基因近3′端亲水区的一段序列，其氨基酸序列为：

tkgsymev ednrsqvete dlilkpgvvh vididrgeek kgkd

核苷酸序列为：

781                                 tgtcctgatg tggagctcaa acgtcgcctt

841aaggaagcct tcagcaaagc cgcgcagcag acaaaaggga gctacatgga ggtggaggac

901aaccggagcc aagtggagac ggaagacttg atcctg

2.如权利要求1所述的原核表达GST-AQP4融合蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于利用GST表达系统获得GST-AQP4融合蛋白，再经免疫兔获得抗GST-AQP4抗血清，具体包括四步：

第一步，PCR-PMD18-T/AQP4重组质粒的构建，小鼠AQP4基因全长从Genebank得到，基因序列号为NM009700，以p8p64为模板，上游引物为5’-GAATTCGACAACCGGAGCCAAGTG，含EcoR1酶切位点；下游引物为5’-CTCGAGTACGGAAGACAATACCTC，含XhoI酶切位点，扩增得到的片段与PMD18-T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以EcoR I和Xhol I双酶切鉴定并测序；

第二步，原核表达载体pGEX-4T-1的构建，将含有AQP4基因近3′端亲水区片段的pMD18-T质粒经EcoR I和Xho1双酶切后，利用回收试剂盒获得AQP4基因该区片段，同时用相同的酶处理质粒pGEX-4T-1，然后将回收的AQP4基因近3′端亲水区片段和经酶切的载体pGEX-4T-1在T4 DNA连接酶作用下于16℃连接过夜，酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定；

第三步，GST-AQP4融合蛋白的诱导表达和纯化，重组质粒PGEX-4T-1/AQP1转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落接入LB/Ampr培养基中，37℃振摇培养过夜，次日，将培养物按1∶50的比例转接于含Amp+的LB培养基中，继续在37℃摇床培养至对数生长中期，在培养液的A600为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.08mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置25℃继续培养4～5h，离心收集菌体，以SDS-PAGE进行鉴定GST-AQP4融合蛋白的表达，并优化表达条件，进行大量扩增诱导，以5000r/min于4℃离心5min，收集菌体，用60mL冰预冷的NETN悬浮1L菌液的沉淀，用超声裂解细菌，再以9600rpm，于4℃离心15min，取上清，过Glutathione-Sepharose 4B柱，先以等体积洗脱缓冲液1，含20mM谷胱甘肽、50mM Triscl，pH＝8.0，洗脱，收集洗脱液，再以等体积洗脱缓冲液2，含100mM谷胱甘肽，洗两遍，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定纯化产物；

第四步，兔抗AQP4抗血清的制备及免疫学检测，以纯化的AQP4融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500μg融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射，免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照，2wk后进行第1次加强免疫，500μg纯化的GST-AQP4融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射，之后每隔2wk加强免疫1次，于末次免疫后1wk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1∶100000时，颈动脉放血，收集血清，采用间接ELISA方法测定血清抗体的效价，并采用Western blot方法分析抗AQP4血清特异性，将纯化的融合蛋白GST2LZP3样品，经SDS-PAGE分离后再电转移至硝酸纤维素膜上，以5％脱脂奶粉封闭1h，依次滴加兔抗鼠LZP3抗血清，室温2h、PBS洗3次，山羊抗兔IgG2HRP，室温反应1h、PBS洗涤3次，最后加底物DAB显色，并拍照。

3.如权利要求1所述的GST-AQP4融合蛋白的原核表达的多克隆抗体在检测水通道蛋白4(AQP4)和深入研究水通道蛋白4(AQP4)功能中的应用。