[发明专利]一种用于HEK293细胞高效表达外源基因的表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于HEK293细胞高效表达外源基因的表达载体。具体地说是利用HEK293细胞的看家基因肽延伸因子的转录调控序列促进外源基因在HEK293细胞中的高效表达。

背景技术

HEK293细胞是Graham等在1977年构建的永生化人胚肾上皮细胞系。因其具有良好的翻译后修饰能力而被广泛的用于诸多人源蛋白质的功能研究，同时它也被广泛的用作病毒的包装宿主。在细胞工程领域，HEK293细胞也得到了应用，例如生产人蛋白C。人源宿主细胞中所特有的一些酶类有利于帮助重组蛋白折叠成正确的构象从而改善其生物学活性。例如，人源宿主细胞中存在α-2，6唾液酸转移酶，它对蛋白进行α-2，6位的唾液酸修饰，能提高蛋白的生物学活性，具有α-2，6唾液酸连接的低聚糖的tPA(tissue plasminogen activator，组织型纤溶酶原激活剂)产品质量提高。在人源宿主细胞中含有β1，4-N-羟乙酰神经氨酸转移酶III(GnTIII)，对目的蛋白进行修饰，可延长糖蛋白的半衰期。用具有此酶的宿主细胞生产的单克隆抗体，对于诱导ADCC(antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导细胞毒作用)更为有效，可减少抗体用量。因此有必要开发以人源细胞为宿主的重组蛋白表达系统。

启动子的强弱直接关系到外源基因在宿主细胞中的表达水平，为提高外源基因的转录效率，必须尽可能的选用高活性的启动子。目前在真核细胞中最常用的启动子为人的CMV启动子，它有比较广泛的宿主细胞，也是比较强的启动子。但是研究发现，该启动子内存在CpG岛容易导致沉默效应；仅在细胞周期的S期起作用，因此寻找比CMV更好的启动子是必要的。人们一直在寻找，高强度适应性广的启动子，Kalwy S用鼠的mCMV启动子在CHO-K1细胞中表达GFP，是人的CMV启动子的3倍，但在表达抗体这样的蛋白时，表达能力却比较弱不如人的CMV启动子。Gershon TJ等通过人工设计合成了一个能够增加基因表达的核心启动子，体内外研究表明：它比CMV核心启动子显著性提高报告基因荧光素酶的表达水平，这就为寻找高活性启动子提供了另一种思路，有可能创造出自然界不存在的高强度的人工启动子。ProBioGen公司，克隆了细胞内广泛存在的启动子，强度比CMV强，非细胞周期依赖，能够对抗基因沉默，在细胞中稳定表达50代以上，很可能细胞内源性启动子更有利于重组蛋白基因的转录调控。

肽延伸因子在细胞整个周期中都处于高表达，不受细胞周期影响的看家基因，其基因座序列可能含有一些有利于基因表达的转录调控序列，与细胞的反式作用因子共同作用，促进基因的高表达。我们根据Genbank的报告的序列，克隆了HEK293细胞的肽延伸因子1的5′端和3′端4Kb的调控序列，用来构建不同的表达载体，以EGFP为报告基因，确定了同时存在肽延伸因子1的5’端和3’端的调控序列时EGFP的表达水平最高，为对照载体的7倍。用这个载体在HEK293细胞中表达外源基因tPA和proUK能够提高表达2-5倍。

肽延伸因子的转录调控序列与我们构建的人工转录因子结合，能够提高EGFP的表达15倍。

发明内容

本发明的目的是提供一种在HEK293细胞中高效表达外源基因的载体。

本发明的另一目的在于提供上述载体的构建方法。

本发明的第三个目的在于是提供这种载体的调控元件的核苷酸序列，其具有序列表中SEQ No.1和SEQ No.2所述的序列。

本发明的第四个目的是提供调控元件的组合应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

培养HEK293细胞，然后提取基因组DNA，通过PCR的方法扩增人HEK293细胞的肽延伸因子1的5’端和3’端4kb的调控序列，用调控序列的不同组合，以EGFP为报告基因，通过流式细胞仪测定EGFP的荧光强度，确定载体的最佳组合，再用外源基因tPA和proUK(prourokinase，尿激酶原)验证其有效性。

一种用于HEK293细胞高效表达外源基因的表达载体，其具有图2E所示结构。