[发明专利]一种用于HEK293细胞高效表达外源基因的表达载体

权利要求书

1.一种转录调控外源基因在HEK293细胞中高效表达的5’端核苷酸序列，其具有序列表中SEQ ID No.1所述的序列。

2.一种调控外源基因在HEK293细胞中高效表达的3’端核苷酸序列，其具有序列表中SEQ ID No.2所述的序列。

3.人的肽延伸因子1的基因5’端和3’端转录调控序列组合构建的高效表达载体。

4.一种用于HEK293细胞高效表达外源基因的表达载体，其特征在于，其具有图2E所示结构。

5.根据权利要求4所述的用于HEK293细胞高效表达外源基因的表达载体，其特征在于，其是对pCDNA3.1(+)进行改构，引物BGH1(SEQ ID No.7)含XbaI酶切位点，BGH2(SEQ ID No.8)含BspEI酶切位点，FOR1(SEQ ID No.9)含BspEI酶切位点，FOR2(SEQ ID No.10)含XmaI酶切位点；通过PCR的方法以pCDNA3.1(+)为模板，分别扩增出200bp和800bp的片断，胶回收后分别用XbaI、BspEI酶切200bp的片段，BspEI、XmaI酶切800bp的片断，XbaI、XmaI酶切后胶回收大片断，再将载体与200bp和800bp片断连接，至此在pcDNA3.1(+)的BGHPA处引入BspEI酶切位点；在改构的pcDNA3.1(+)的EcoRV处连入EGFP报告基因得出pcDNA3.1(+)/EGFP载体，利用SEQ ID No.1所示的肽延伸因子1基因5’端调控序列和SEQ ID No.2所示的肽延伸因子1基因3’端调控序列替代替换pcDNA3.1(+)/EGFP中的CMV启动子和BGHPA。

6.根据权利要求5所述的用于HEK293细胞高效表达外源基因的表达载体，其特征在于，在权利要求5所述载体的上游加上人工转录因子结合序列2UAS。

7.一种构建权利要求5所述载体的方法，其特征在于，具有如下步骤：

(1)提取HEK293基因组DNA；

(2)利用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示引物扩增肽延伸因子1的4Kb的5’端调控序列，扩增产物含NheI和MluI酶切位点，所述肽延伸因子1的5’端调控序列具有SEQ ID No.1所示序列；

(3)再利用SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示引物扩增肽延伸因子1的4Kb的3’端调控序列，所述肽延伸因子1的3’端调控序列具有SEQ ID No.2所示序列，扩增产物含XbaI和BspEI酶切位点；

(4)对pCDNA3.1(+)进行改构，引物BGH1(SEQ ID No.7)含XbaI酶切位点，BGH2(SEQ ID No.8)含BspEI酶切位点，FOR1(SEQ ID No.9)含BspEI酶切位点，FOR2(SEQID No.10)含XmaI酶切位点；通过PCR的方法以pCDNA3.1(+)为模板，分别扩增出200bp和800bp的片断，胶回收后分别用XbaI、BspEI酶切200bp的片段，BspEI、XmaI酶切800bp的片断，XbaI、XmaI酶切后胶回收大片断，再将载体与200bp和800bp片断连接，至此在pcDNA3.1(+)的BGHPA处引入BspEI酶切位点；

(5)在步骤(4)改构的pcDNA3.1(+)的EcoRV处连入EGFP报告基因得出pcDNA3.1(+)/EGFP载体；

(6)利用SEQ ID No.1所示的肽延伸因子1基因5’端调控序列和SEQ ID No.2所示的肽延伸因子1基因3’端调控序列替代替换pcDNA3.1(+)/EGFP中的CMV启动子和BGHPA。

8.一种构建权利要求6所述载体的方法，其特征在于，在权利要求6所述步骤(6)制备得到都得载体上游加上人工转录因子结合序列2UAS。

9.一种用于扩增权利要求1所述转录调控外源基因在HEK293细胞中高效表达的5’端核苷酸序列的引物，其特征在于，所述引物具有SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示序列。

10.一种用于扩增权利要求2所述转录调控外源基因在HEK293细胞中高效表达的3’端核苷酸序列的引物，其特征在于，所述引物具有SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6所示序列。