[发明专利]筛选可逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学、基因工程、肿瘤学以及医学相关领域。更具体的，本发明涉及两种肿瘤工程细胞的构建。通过在来源细胞基因组中稳定的整合一段启动子区域被过甲基化的荧光基因，该肿瘤工程细胞可以选择性的且灵敏的对可逆转基因沉寂的物质产生荧光反应。此外，本发明还涉及使用该两种肿瘤工程细胞为模型，筛选可逆转基因沉寂的药物及疗法的方法。

背景技术

在探索生命科学与人类疾病的关系中，我们很早就了解并接受了这样一个发现-遗传密码的变异普遍的存在于各种疾病中。而随着越来越多人类疾病建立起了与遗传物质(DNA，RNA)核酸序列的增、减、替代、重组的关联，我们已经确立起这样一个概念和共识：大多数(如果不能说是绝大多数的话)疾病的起源，就是一种或数种被改变(变异)的遗传状态。特别是对于现代人类头号杀手之一的癌症更是如此。事实上，癌症也一直都被认为是一种基因变异所致的疾病(Hanahan和Weinberg，Cell 2000，100：57-70)。然而，随着对癌症分子机理的深入研究以及对染色质变化的观测在技术上成为可能，生物医学科学家们在肿瘤细胞中发现了一种更为普遍的分子损伤(既导致癌变的原因)-表观遗传学修饰水平上的基因沉寂-它甚至比基因本身的变异导致了更多的肿瘤形成。

表观遗传学研究的是基于非基因序列改变所致的基因表达水平变化，其中两个最为关键的分子因素是DNA甲基化以及组蛋白修饰引起的染色质构象变化。组蛋白是将DNA包裹进核小体(组成染色质的最小单元)的一组小蛋白。每个核小体由8个组蛋白以及147个DNA碱基对共同组成。这些组蛋白的氨基端(N-端)从核小体内核中延伸出来，形成了组蛋白尾，而组蛋白尾部上的氨基酸则可以被乙酰基化、甲基化、磷酸化、泛素化等方式修饰。这些修饰的组合构成了复杂的组蛋白密码。基于组蛋白密码，激活或抑制蛋白被吸引到核小体的DNA上，决定这一段的染色质是以松散(基因表达)还是紧密(基因沉寂)的形式存在。在组蛋白修饰中，组蛋白乙酰基化是DNA激活状态的重要标志。

与组蛋白令人眼花缭乱的复杂修饰相比，DNA甲基化相对来说较为简单，是将单个甲基(CH₃-)添加到胞嘧啶的5位上。在哺乳动物中这样的修饰只发生在位于鸟嘌呤之前的胞嘧啶上，因此被称为CpG(既cytosine preceding guanine)。在约半数的人类基因的启动子区域存在着由几十至上百CpG组成的CpG岛，其胞嘧啶在正常细胞中一般未被甲基化。

在绝大多数的肿瘤细胞中，大量抑癌基因启动子区域的CpG岛出现了过甲基化现象。受影响的(启动子被过甲基化)基因将被永久的沉寂。由于DNA的甲基化可以随着有丝分裂在甲基化转移酶(DNMT)的作用下维持和扩增，又由于这些获得过甲基化从而抑制某些抑癌基因表达的细胞群获得了相对正常细胞的生存优势，这样的表观遗传学损伤将会逐渐积累、放大、叠加，最终导致癌变的发生。在人类肿瘤中，数以百计到千计的基因会因为启动子过甲基化而被沉寂，这种表现形在肿瘤学中被命名为CpG岛甲基化表现型(CIMP)。CIMP最初在直结肠癌中被发现，而其后的研究在几乎所有的肿瘤与白血病类型中发现与确认了其存在(Issa，Nature Review Cancer 2004，4：988-993)。表观遗传学水平上的DNA过甲基化在肿瘤中的发生率相比基因变异来说更为频繁得多。在多种人类乳腺癌与直结肠癌中进行的、超过20,000个转录子的大规模测序研究发现，DNA过甲基化引起的可致癌的基因沉寂是可致癌的基因变异的10-100倍(Wood等，Science 2007，318：1108-13)。举例来说，Wnt细胞信号通路的过度活性长期被认为是癌症发生过程中重要的早期事件。实验证明，Wnt信号通路的过度活性与SFRP基因的沉寂相关。SFRP蛋白可以抑制Wnt受体，进而抑制Wnt信号通路。而启动子区域的过甲基化是导致SFRP基因沉寂的直接原因。此外，表观遗传学水平的启动子区域过甲基化导致的基因沉寂还会抑制那些修复或阻止DNA损伤的基因，从而导致癌变的发生。比如，抑癌基因p16^NK4a的基因沉寂被发现普遍存在于上皮癌症、乳腺癌、淋巴癌以及淋巴细胞贫血症中。类似的，GST-PI基因的沉寂被发现存在于几乎所有的前列腺癌。对于直结肠癌，70-80％的患者的DNA错配修复基因MLH1发生基因沉寂。对于乳腺癌，BRCA1、p16^1NK4a、E-cadherin、TIMP-3、CDH1、TWIST、CCND2等众多抑癌基因因为启动子区域过甲基化而发生沉寂。过甲基化导致的抑癌基因沉寂是肿瘤发生的主因之一。