[发明专利]一种黄菖蒲愈伤组织的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种黄菖蒲愈伤组织的培养方法。

背景技术

尽管转基因技术存在争议，但是转基因植物在农业生产、环境保护、医疗等领域应 用日益广泛。用于构建转基因植物的方法有多种，但是目前最为成熟的方法是经农杆菌 介导的方法。通常，取目的植物外植体诱导出愈伤组织，用于转基因操作。

此外，植物的快速繁殖常常需要将植物体的一部分诱导成愈伤组织，愈伤组织再经 再分化步骤形成完整植株，实现植物的快速繁殖。

再次，植物愈伤组织可用于种质资源的保存，可将优良品种的植株诱导成愈伤组织， 愈伤组织通过分化形成性状不发生改变的子代，以利于优良品种的传代。

最后，黄菖蒲属于一年生挺水植物或岸生植物，多用于人工景观生态系统的构建。 黄菖蒲具有发达的根系，能够吸收重金属，且具有一定的耐污能力。由于黄菖蒲具有较 大的生物量，具有一定的去除水体氮磷和有机污染的能力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简单易行的黄菖蒲愈伤组织的培养方法，以 使愈伤组织在短时间内得到快速增殖而不需愈伤组织重新诱导，从而为植物转基因提供 大量的材料。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种黄菖蒲愈伤组织的培养方法，它包括如下步骤：

(1)当黄菖蒲种子胚芽上的愈伤组织直径超过0.5cm时，将其从种子胚芽上切除， 接种到新鲜的固体继代培养基上，进行继代培养，此后每2周继代培养一次；

(2)取出一粒经步骤(1)继代培养的愈伤组织(直径约为0.5～1cm)在无菌滤纸 上用镊子夹成直径为0.1～0.2cm的小块，放入新鲜的培养液中，在25℃、90转/分钟条 件下培养2周，形成愈伤组织悬浮液，将愈伤组织悬浮液按1∶30(v/v)接种到新鲜的培 养液中进行继代培养，继代培养周期为2周；

(3)当需要使用愈伤组织进行快速繁殖或者转基因时，使用50目孔径的无菌尼龙 膜过滤步骤(2)中的愈伤组织悬浮液，得到的大块愈伤组织(即不能通过50目孔径的 愈伤组织)转接到固体继代培养基上备用(例如后续的快繁或转基因操作)，过滤后剩 余的愈伤组织悬浮液继续按照步骤(2)的方法培养；

步骤(1)和(3)中，所述的固体继代培养基组分如下：MS培养基，另加终浓度 为30g/L的蔗糖，500mg/L的水解酪蛋白，2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，3g/L琼 脂糖；

步骤(2)中，所述的培养液组分如下：MS培养基，另加终浓度为30g/L的蔗糖、 500mg/L的水解酪蛋白、2mg/L 2，4-D；

其中，黄菖蒲种子胚芽上的愈伤组织按如下方法诱导：将灭过菌的黄菖蒲种子接种 到固体培养基上，置于25℃、黑暗条件下培养2周，诱导出愈伤组织；所述的固体培养 基组分如下：MS培养基，另加终浓度为30g/L的蔗糖，500mg/L的水解酪蛋白，2mg/L 2，4-D，3g/L琼脂糖。

上述黄菖蒲种子按如下方法灭菌：

(a)采集黄菖蒲种子，手工去除外壳；

(b)将步骤(a)处理后的种子置于自来水下冲洗干净；

(c)将步骤(b)处理后的种子泡在浓度为0.01％(v/v)的Tween 80水溶液中，搅 拌24～48小时；

(d)用蒸馏水冲洗步骤(c)处理后的种子，直到水澄清为止；

(e)将步骤(d)处理后的种子放到75％(v/v)的酒精中，搅拌90～120秒；

(f)将酒精倾倒出去，加入灭菌的蒸馏水，冲洗3～4次；

(g)将步骤(f)处理后的上述种子放入30％(v/v)的次氯酸钠溶液中，搅拌30～60 分钟；

(h)将次氯酸钠溶液倾倒出去，用灭菌的蒸馏水冲洗种子6～8次。

有益效果：本发明中，建立了黄菖蒲愈伤组织的悬浮培养体系，该体系的建立，能 够很好的保存愈伤组织，这种继代培养的方式比固体培养基得到的愈伤组织更加致密， 表面更加光滑，颜色更加均一。同时，悬浮培养建立后，愈伤组织可以不断增殖，形成 很多小块的愈伤组织，使愈伤组织数量迅速得到扩大。从而避免愈伤组织的从头诱导， 节省时间，成本。另，新鲜的黄菖蒲种子只在秋季能够采集到。老的种子往往附生大量 微生物，对实验造成较大的困难。建立本发明的悬浮培养体系之后，可以避免因种子问 题产生的困境。