[发明专利]适于PCR反应的快速提取食用菌基因组DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速提取食用菌基因组DNA的方法，属于生物技术领域。

背景技术

近年来，随着食用菌产业的迅速发展，对于食用菌的基础研究已深入到分子水平。一方面各种DNA分子标记技术已应用到食用菌的分类鉴定和遗传多样性研究中，另一方面食用菌基因工程的研究日益深入，从各种食用菌中快速提取基因组DNA是这些工作的前提。

食用菌的细胞壁及染色体上结合有复杂的多糖和丰富的蛋白质，且其菌丝体通常会产生色素，致使制备的基因组DNA中含有不同数量的多糖、蛋白质、色素以及成分不明的胞壁物质，这些物质的存在会影响后续实验。

目前已有多种从食用菌的菌丝体及子实体中提取DNA方法的报道，提取方法步骤大体相似，区别在于破壁方法的不同。常用的破壁方法主要有液氮研磨法、石英砂或玻璃珠机械破壁法、CTAB法和氯化苄法等。最初用于细菌基因组DNA的提取的CTAB法，利用在一定的盐浓度下，DNA与多糖在CTAB溶液中溶解度不一样而达到去多糖的目的。自将CTAB法引入植物分子系统学研究领域，并在其后的研究中被逐步改进。但是改方法步骤多，操作繁琐，费时费力。此后改进了的CTAB法由于大都不能避免液氮研磨这一步骤，在处理的样品多的时候不占优势。国内多采用建立的氯化苄提取法，这一方法具有简便易行的优点，但也存在提取DNA质量不够稳定，对分散性不好的材料提取效果不好等不足。近年来，很多研究者针对如何快速提取食用菌的基因组做了大量的研究，孙立夫等(菌物学报，2009年28卷第2期299-302)采用带有无菌塑料钻头的小型手动电钻来研磨成功提取了蜜环菌总DNA，该方法虽然避开了使用液氮，但仍然有费时的缺点；赵春喜等(安徽农业科学，2008年36卷第28期：12122-12200)尝试采用改进的TRIS饱和酚一步法从各种食用菌子实体中提取高质量DNA的简捷方法，获得的食用菌DNA质量较好，能够满足PCR等后续分子生物学试验，但此方法中仍然采用了可能对人和环境产生影响的酚仿抽提的方法；杨同文等(生物技术，2009年19卷第1期：32-34)探索出一种简捷、高效CTAB结合DNA凝胶试剂盒的方法，省去了苯酚-氯仿的抽提，免去了DNA的晾干和再溶解等步骤将CTAB的裂解功能与胶回收试剂盒的纯化功能有机结合，优化组合操作步骤，成功提取了平菇、香菇、金针菇子实体DNA，但该方法，成本较高。

总之，目前提取食用菌基因组DNA的提取方法普遍存在操作繁琐、提取时间长、成本较高、毒性较大等不足之处。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提取食用菌基因组DNA的方法，用该方法提取食用菌的基因组DNA时间短、速度快、操作简单、成本低、提取效率高，对环境无污染，提取的DNA质量稳定，适于PCR反应。

本发明提供的技术方案是：一种适于PCR反应的快速提取食用菌基因组DNA的方法，包括以下步骤：

(1)取材：取菌丝体或子实体于离心管中；

(2)加入少量石英砂或玻璃珠后，用研磨杵对菌丝体或子实体进行研磨至糊状；

(3)加入抽提缓冲液，涡旋振荡1-3min；

(4)水浴10-15min；

(5)加入乙酸铵溶液，冰中放置8-10min；

(6)离心：10,000-13,000r/min离心10-15min；

(7)取上层水相至另一离心管中，加入冰预冷的异丙醇或无水乙醇，颠倒混匀，-20℃-4℃放置沉淀15-30min；

(8)离心：10,000-13,000r/min离心10-13min；

(9)弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，风干；

(10)加入ddH₂O和RNaseA溶液中，完全溶解沉淀，-20℃保存。

上述第(1)步取材，菌丝体取气生菌丝；子实体取菌盖部位，将取好的材料置于1.5mL离心管中。

上述第(3)步中，加入0.5mL的抽提缓冲液，所述抽提缓冲液为200mmol/L Tris-HCl，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA和2％SDS的混和液，涡旋振荡2min。

所述Tris-HCl的pH值为8.5。

上述第(4)步中，水浴温度为65℃。

上述第(5)步中，水浴后立即加入浓度为10mol/L的乙酸铵溶液200μL。

上述第(7)步中，加入异丙醇或无水乙醇的体积为上层水相体积的0.5-0.6倍，温度为0-4℃。

上述第(7)步中，放置沉淀的温度为0℃以下，例如：-20℃。