[发明专利]一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，属于基因工程菌株构建方法，具体涉及一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法。

背景技术

为应对愈演愈烈的石油危机，世界各国都在积极制定和实施新的能源发展战略，希望通过各种可能途径寻找到新的石油替代品，生物柴油便是其中之一。目前，生产生物柴油的原料主要依赖于油料作物、木本油料人工林、动物脂肪及废弃油脂等。从油料树木中提取油脂，具有占用耕地面积、周期长、成本高等一系列制约因素。发展动物油脂也同样面临一系列制约因素。因此，开辟新的植物源油脂生产途径，特别是工业化生产途径对满足不断增长的生物柴油的需求具有重要意义。

研究发现，除高等植物和动物能生产油脂外，低等的微生物也能产生油脂，大部分微生物油脂的脂肪酸组成和一般植物油相似。通常情况下微生物细胞仅含油2～3％，但在适宜条件下，某些微生物产生并贮存的油脂占其生物总量的20％以上，在已知细菌、酵母、霉菌和藻类中都发现有产油脂的菌株。酵母是一种繁殖速度很快的生物，利用酵母作为生物反应器生产脂肪酸，为生物柴油原料生产开辟了一条新的技术途径。酵母生产油脂时，具有增殖快，生长周期短，适合工厂化生产，投入较少，收获稳定，不受季节、气候等环境条件影响，且不消耗化学肥料和农药，因而对环境污染减轻。但目前常见的产油酵母存在产油率低，油脂成分组成复杂，与生产优质生物柴油的原料要求仍为较大距离。

运用分子生物学技术，将植物脂肪酸合成相关基因特别是控制产脂量和脂肪酸品质的基因导入酵母中，构建优质“基因工程菌株”，使植物脂肪酸合成酶基因在酵母细胞中的高效表达，增加酵母产油量，提高和控制脂肪酸组成。此种新方式可从根本上解决酵母产脂菌油质差、产油率低的缺陷，又可充分发挥酵母适合于生物反应器发酵以及林源优质脂肪酸合成酶的优点。

Δ9硬脂酰-ACP脱饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase，简称：SAD)是目前研究最多、最广泛的Acyl-ACP脱饱和酶。该酶催化的反应是在第9～10碳原子之间形成第一个双键，是不饱和脂肪酸生物合成途径的第一步脱饱和，直接调控膜脂与贮脂中饱和与不饱和脂肪酸的比例，该酶对调节油料作物种子中脂肪酸含量和组分具有非常重要的意义。千年桐是生产生物柴油的理想树种之一，将千年桐的SAD基因(VeSAD)构建在酵母表达载体上并整合到产油酵母中高效表达，使产油酵母的饱和脂肪酸向油酸转化，从而大大提高油脂成分中油酸的含量，为酵母产油符合生物柴油的质量要求奠定基础。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法，提供一种高产油酸的酵母工程菌株，该载体以pCAMBIA2300为基本骨架，含有千年桐VeSAD基因，可以改变产油酵母脂肪酸成分从而提高油酸含量，从而提高浅白隐球酵母的油脂含量，该菌株的名称为Cryptococcus albidus VeSAD-1，保存在中国林业科学研究院亚热带林业研究所观赏植物研究组实验室。

用于本发明工程菌株Cryptococcus albidus pCAM2300-sad中表达千年桐VeSAD基因的质粒是pCAM2300-sad，构建过程如图1所示。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法，在酵母基因组中含有千年桐VeSAD基因表达盒，该表达盒依次含有CaMV35S启动子、千年桐VeSAD序列、终止密码子，其中所述的酵母是浅白隐球酵母；该方法的步骤如下：

(1)、含酶切位点千年桐VeSAD基因cDNA编码区全长序列获得

根据千年桐VeSAD基因(GenBank登录号为EU072353)核苷酸序列设计引物，以千年桐未成熟种子总RNA为模板，经RT-PCR扩增，在VeSAD上游引入Sal I酶切位点，下游引入Kpn I酶切位点，电泳回收VeSAD基因cDNA片段，克隆到pGEM T-Easy载体，转化大肠杆菌DH5α，测序，命名该载体为pGEM-T-sad；

(2)、VeSAD正义表达载体构建