[发明专利]一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法

权利要求书

1.一种高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法，其特征是：在酵母基因组中含有千年桐VeSAD基因表达盒，该表达盒依次含有CaMV35S启动子、千年桐VeSAD序列、终止密码子，其中所述的酵母是浅白隐球酵母；该方法的步骤如下：

(1)、含酶切位点千年桐VeSAD基因cDNA编码区全长序列获得

根据千年桐VeSAD基因核苷酸序列设计引物，以千年桐未成熟种子总RNA为模板，经RT-PCR扩增，在VeSAD上游引入Sal I酶切位点，下游引入Kpn I酶切位点，电泳回收VeSAD基因cDNA片段，克隆到pGEM T-Easy载体，转化大肠杆菌DH5α，测序，命名该载体为pGEM-T-sad；

(2)、VeSAD正义表达载体构建

结合表达载体pCAMBIA2300的限制性酶切位点——Kpn I、Sma I、BamH I、Xba I、SalI、Pst I，选用Sal I、Kpn I两个位置来作为插入目的片段的酶切位点，设计带Sal I、Kpn I酶切位点的引物，以克隆载体质粒pGEM-T-Vesad为模板进行PCR反应；将扩增产物与表达载体pCAM2300一起均用Sal I和Kpn I双酶切；分别回收相应的片段，用T₄DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH 5α感受态细胞；提取质粒进行酶切鉴定，表达载体命名为pCAM2300-sad；

(3)重组农杆菌菌株获得

采用冻溶法将重组表达载体pCAM2300-sad农杆菌菌株EHA105、LBA4404、AGL-1；

(4)浅白隐球酵母工程菌株的获得

采用农杆菌介导法，活化含重组表达载体的农杆菌，与浅白隐球酵母菌液共培养，转移到含卡那霉素的筛选培养基上，获得具有卡那霉素抗性的转化子，经PCR和Southern分子鉴定，表明千年桐VeSAD基因已经插入浅白隐球酵母的基因组中。

2.根据权利要求1所述的高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法，其特征是：PCR扩增VeSAD基因含酶切位点cDNA编码区全长，根据在GenBank上登录的VeSAD基因核苷酸和氨基酸序列设计兼并引物，引物序列如下：

Vesad FP：GAT GTC GAC ATG GCA CTC AAG CT

Vesad RP：GAC GGT ACC TAA CAG CTG CAC TT

其中Vesad FP含酶切位点Sal I，Vesad RP含酶切位点Kpn I，以cDNA为模板，PCR扩增千年桐VeSAD基因cDNA编码区，扩增条件为：94℃预变性4min，94℃30S、58℃30S、72℃1min，30个循环，72℃延伸10min；扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

3.根据权利要求1所述的高产油酸的浅白隐球酵母工程菌株的构建方法，其特征是：所述的产油酵母表达载体pCAM2300-sad含有千年桐VeSAD基因。