[发明专利]利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分析贝类遗传多样性的方法，更具体地说是一种利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法。

背景技术

AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)技术是目前使用广泛且有效的遗传多样性检测方法，它集RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism，限制性片段长度多态性)技术的稳定性和RAPD(Random AmplifiedPolymorphism DNA，随机扩增多态性DNA)技术的高效性于一身，具有所需DNA量小、标记信息量大、多态性丰富、灵敏度高、快速高效、所得数据可靠等诸多优点，且不需预先知道研究生物的遗传背景，不受组织器官种类、发育阶段、生境条件等因素的影响，结果遵从孟德尔分离的特点，已被广泛应用于多种生物的遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱构建、目的基因的克隆和定位等多个遗传学研究领域。在贝类研究方面，潘洁等(2002)应用AFLP技术对栉孔扇贝的中国长岛群体和韩国东部、韩国西部群体3个群体进行了遗传多样性分析。陈省平等(2005)对我国4种主要养殖扇贝——栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、虾夷扇贝、海湾扇贝的群体遗传多样性及特异性AFLP标记进行了研究；万俊芬等(2004)研究了鲍养殖群体AFLP标记位点及其遗传结构的影响。另外，潘洁等(2002)对栉孔扇贝抗病品系的AFLP标记进行了分析，发现选育群体的遗传组成已经发生了一些改变。

近年发展起来的fAFLP(荧光AFLP)技术是在传统AFLP技术的基础上，利用荧光物质(FAM、ROX、JOE等)标记过的选择性引物扩增，产物在自动DNA测序仪上进行检测，所得图像和数据可以自动采集，并且由于荧光内参的使用使实验结果更具准确性和可比性。相对于传统AFLP技术来说，fAFLP技术省去了做胶、银染的麻烦和不稳定。

所以，fAFLP技术不仅秉承了传统技术的优点，而且在高效性、稳定性、准确性和可重复性等方面表现得更加优越，将成为分子标记技术发展的主流和趋势。目前在海洋贝类方面，彭永兴等(2008)利用fAFLP技术对文蛤(Meretrix meretrix)、青蛤(Cyclinasinensis)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)和硬壳蛤(Mercenaria mercenaria)4种帘蛤科贝类的群体遗传多样性和种间关系进行了研究，该文献中对酶切、预扩增、选择性扩增方面作了试验，并给我们提供了一组反应体系；林志华等(2009)利用fAFLP标记技术，对采集于广西的形态和壳色变异很大的2个文蛤群体以及山东文蛤群体进行了遗传结构和亲缘关系研究，该文献在酶切、预扩增、选择性扩增方面没有提供可参考的反应体系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而另外提供一种高效、稳定、准确的利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法，依次经过贝类DNA提取，限制性内切酶消化DNA，对酶切后的DNA进行接头连接，PCR预扩增和选择性扩增，产物检测及图像和数据的采集和分析，其特征在于所述的PCR预扩增和选择性扩增包括如下步骤：

a、DNA片段的预扩增：取5μL连接完成的DNA样品，加入：50ng/μL的Mse I引物1.5μL，50ng/μL的EcoR I引物1.5μL，10×PCR Buffer 5.0μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，2.5mM d NTP 4.0μL，加水至50μL，混匀后，在如下PCR条件扩增：94℃预变性2min，94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸60S，20个循环，引物带有一个碱基，为M00+C，预扩增完成后，在1％琼脂糖胶中检测预扩增的效果；

预扩增引物为：E01：5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′；M02：5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′；