[发明专利]利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法

权利要求书

1.一种利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法，依次经过贝类DNA提取，限制性内切酶消化DNA，对酶切后的DNA进行接头连接，PCR预扩增和选择性扩增，产物检测及图像和数据的采集和分析，其特征在于所述的PCR预扩增和选择性扩增包括如下步骤：

a、DNA片段的预扩增：取5μL连接完成的DNA样品，加入：50ng/μL的Mse I引物1.5μL，50ng/μL的EcoR I引物1.5μL，10×PCR Buffer 5.0μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，2.5mM d NTP 4.0μL，加水至50μL，混匀后，在如下PCR条件扩增：94℃预变性2min，94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸60S，20个循环，引物带有一个碱基，为M00+C，预扩增完成后，在1％琼脂糖胶中检测预扩增的效果；

预扩增引物为：E01：5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′；M02：5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′；

b、AFLP的选择性扩增：荧光引物是在EcoR I引物的5′端加了荧光标记，用多对引物组合对各个体进行了选择性扩增，取5μL稀释的预扩增混合液，加入：50ng/μL的EcoR I引物1μL，50ng/μL的Mse I引物1μL，2.5mM dNTP 1.6μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，10×PCR Buffer 2.0μL，加H₂O至20μL，PCR扩增：94℃预变性2min，94℃变性30S，65℃退火30S，72℃延伸60S，进行12个循环，每个循环退火温度降低0.7℃，至56℃；94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸60S，进行8个循环，扩增完成后，取5μL在1％琼脂糖胶中检测扩增效果，扩增后的样品中加入15μL变性Buffer，混合，95℃变性5min后，立刻冷却到4℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的DNA提取为如下步骤：取贝类的肌肉组织或内脏团，用酚/氯仿法提取基因组DNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测DNA的纯度和完整性，调整所有样品DNA的浓度在100ng/μL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的限制性内切酶消化DNA为如下步骤：用EcoR I、Mse I两种核酸内切酶酶切，每个DNA样品酶切的混合液包括：DNA100ng，Mse I 5U，EcoR I 5U，酶切Buffer 8μL，加水至50μL，37℃酶切3～6h，酶切完成后，65℃处理10min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的接头和连接处理为如下步骤：取酶切完成后的样品，加入：2μmol/L的EcoR I接头1.0μL，20μmol/L的Mse I接头1.0μL，10mM ATP 1.0μL，10U/μL的T4-DNA连接酶0.2μL，10×连接Buffer 5.0μL，加水至50μL；16℃连接过夜，连接结束后，65℃处理10min，

EcoR I接头：5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′

3′-CTGACGCATGGTTAA-5′，

Mse I接头：5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′

3′-TACTCAGGACTCAT-5′。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的产物检测为如下步骤：在自动DNA测序仪上进行检测：选扩产物在ABI公司的3760 XL型测序仪上进行检测。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的图像和数据的采集和分析为如下步骤：用GeneMarker 1.6软件进行分析，将100-500bp间的扩增带谱转换成0、1数据矩阵，用PopGene 32软件计算各群体的多态率、基因多样性指数、香农信息指数以及种群间的相对遗传距离和遗传相似性系数。