[发明专利]一种甲型肝炎灭活疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种甲型肝炎灭活疫苗的制备方法 以及由所述方法制备的甲型肝炎灭活疫苗。

背景技术

甲型肝炎，简称甲肝，是一类高发病率的病毒性传染病，可导致暴发流 行，我国是甲型肝炎的高流行区，接种甲型肝炎疫苗是预防甲肝流行的最有 效措施。

目前世界上有两种疫苗用于甲肝的预防控制，一种是甲肝减毒活疫苗， 甲型肝炎减毒活疫苗如L-A-1株已规模生产近20年，在预防控制甲肝的暴发 流行、降低发病率方面，起到了巨大作用，但减毒活疫苗存在毒力返祖、对 一些个体如免疫缺陷者可能诱发严重疾病等缺点；另一种为灭活疫苗。甲型 肝炎灭活疫苗免疫后抗体产生快，可用于控制甲肝暴发流行的应急免疫接种， 在安全性、有效性及使用范围等方面均优于减毒活疫苗。近10年来，甲肝灭 活疫苗的应用均显示其具有安全性好、免疫后抗体水平高、保护率高、效期 长、稳定性好的优点。

灭活疫苗常用强毒株制备，在生产过程中存在感染操作者致病的危险， 用减毒株制备甲肝灭活疫苗的操作过程更为安全，且大大提高疫苗的安全性， 因此有必要研制用减毒株制备灭活疫苗，同时实现规模化生产的制备甲肝灭 活疫苗的方法。

发明内容

本发明针对现有技术中制备用强毒株制备甲肝灭活疫苗存在感染风险的 缺陷，提供一种用减毒株制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，该方法所需甲肝病 毒量少，工艺简单，具有规模化应用前景。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，包括如下步骤：

步骤1：将甲型肝炎病毒毒种接种于人胚肺二倍体细胞2BS株，培养至 病毒增殖高峰期，用胰酶常规消化细胞；

步骤2：离心取沉淀加入细胞裂解液，使其充分作用；

步骤3：加入聚乙二醇使其充分作用，离心取沉淀用PBS缓冲液悬浮， 加入氯仿抽提，制备粗制甲肝病毒液；

步骤4：步骤3制备的粗制甲肝病毒液经凝胶层析纯化后，经0.2μm滤 膜除菌，灭活；

步骤5：将步骤4制备的甲肝病毒液经超滤膜超滤，经氢氧化铝佐剂吸 附，制成甲型肝炎灭活疫苗。

作为优选，步骤1所述毒种为甲型肝炎病毒L-A-1减毒株，已于1992 年12月21日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.V92004。

作为优选，步骤1所述培养为利用多层细胞工厂或3L转瓶进行培养。

细胞工厂(cell factory)，是一种设计精巧的细胞培养装置，可在有限 的空间内利用最大限度的培养表面，从而节省了大量的空间，并可节省贵重的 培养液。更重要的是，它可有效地保证操作的无菌性，从而避免因污染而带 来的原料、劳务和时间损失。在本发明的具体实施方式中，采用丹麦NUNC 公司生产的NUNC多层细胞工厂，是目前应用较多的细胞工厂系统，可用于如 疫苗、单克隆抗体或生物制药等工业规模生产，特别适合于贴壁细胞，也可 用于悬浮培养。

作为优选，步骤2具体为离心取沉淀加入细胞裂解液在2-8℃作用16-24 h，所述细胞裂解液为含质量百分比2-5％乙二胺四乙酸二钠的0.2-0.5％去氧 胆酸钠溶液。本发明所述细胞裂解液为发明人经过大量试验研制的细胞裂解 液，可有效裂解病毒感染的细胞，使甲肝病毒充分释放。

步骤3中经PEG沉淀、氯仿抽提，可基本去除细胞杂蛋白。作为优选， 步骤3所述聚乙二醇分子量为6000，终浓度为体积百分比8％～10％。

作为优选，步骤3所述PBS缓冲液为pH 5.5～7.5的0.01-0.02mol/L 的PBS缓冲液。

作为优选，步骤4所述灭活具体为终浓度为200-250μg/ml的甲醛溶液 灭活12-14天。步骤4所述凝胶优选为丙烯葡聚糖凝胶，在具体实施方式中采 用上海索莱宝生物科技有限公司生产的Sephacryl S-400HR。

作为优选，步骤5所述超滤膜的截留分子量为50-100KD。

本发明还提供由所述方法制备的甲型肝炎灭活疫苗。

作为优选，所述疫苗中灭活甲肝病毒浓度为640～1280EU/ml。经小鼠体 内效力试验结果表明，本发明所述甲型肝炎灭活疫苗抗原含量为1280EU/ml 时，半数有效稀释倍数高于参比苗，其免疫原性优于参比苗。