[发明专利]一种采用霉菌固态发酵生产凝乳酶的方法

说明书

【技术领域】

本发明属于生物制剂制备技术领域中凝乳酶的制备方法，特别涉及一种采用霉菌固态发酵生产凝乳酶的方法

【背景技术】

凝乳酶(chymosin，EC3.4.23.4)是一种从未断奶的小牛胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶，可以使牛奶凝固，被广泛用于干酪制造业，成为食品领域中重要的酶制剂，其产值占全世界酶制剂的15％。

凝乳酶的传统制备方法是从出生10-30天的小牛皱胃中浸提得到凝乳酶。随着世界干酪产业的不断发展，每年宰杀5000万头犊牛以获得凝乳酶的方法，仍不能满足生产需要，也与现代工业发展极不协调，因此研究者都在不断寻找新的来源，以促进干酪工业的不断发展。

微生物本身具有生长周期短、代谢物产量大、受气候、地域、时间限制小等优点，利用微生物生产凝乳酶成本较低、酶提取方便、经济效益高，是目前最有前途的发展方向。微生物凝乳酶在干酪生产中的应用也已经有很多报道，其性能与传统凝乳酶无明显差异。

本发明所用霉菌筛选自我国南方的传统食品江米酒酒醪中，无需考虑微生物非酶类代谢产生的安全性问题。

【发明内容】

本发明的目的是针对上述存在问题，提供一种采用霉菌固态发酵生产凝乳酶的方法，该制备方法操作简便、成本低廉、使用安全且代谢产物浓度高，而且节水节能、没有废液产生，有利于环保。

本发明的技术方案：

一种采用霉菌固态发酵生产凝乳酶的方法，所用霉菌筛选自江米酒酒醪，制备步骤包括：

1)将浓度为1.0×10⁶CUF/mL的霉菌孢子悬液，以10％(v/v)接种量接种于固态发酵培养基中，30℃培养96h；

2)向上述培养物中加入2-4倍体积、浓度为0.3mol/L的NaCl溶液，在40℃温度下提取3次，每次抽提时间为20min，制得凝乳酶粗液；

3)采用中空纤维超滤浓缩工艺，将凝乳酶粗液浓缩10-12倍，得到凝乳酶浓缩液；

4)向凝乳酶浓缩液中加入保护剂及载体后进行喷雾干燥，即可制得该凝乳酶制剂。

所述霉菌孢子菌悬液的制备方法是，将霉菌在土豆培养基(PDA)上培养2-3天后，以含有0.01％(m/v)吐温80的无菌水洗涤收集孢子悬液，洗涤3～5次收集孢子，以血球计数板计算孢子数量。

所述固态发酵培养基成分为：糯米∶麸皮为1∶1(m∶m)、液固比为0.9∶1(v∶m)、葡萄糖2.8％(m/v)、Na₂SO₄0.031％(m/v)、吐温800.34％(m/v)、CaSO₄0.04％(m/v)、K₂SO₄0.04％(m/v)。

所述中空纤维超滤膜浓缩工艺中，中空纤维孔径分别为60kDa及6kDa。

所述保护剂为2％-3％(m/v)甘油和4％-5％(m/v)海藻糖，载体为脱脂奶粉，添加后使酶液中固形物含量达到25-30％。

所述喷雾干燥的工艺参数为：进口温度70-75℃，出口温度130-140℃。

本发明的有益效果是：1)采用传统发酵工艺与现代生物技术相结合的方法生产凝乳酶，所产凝乳酶活力高，发酵产物提取简单，残渣易处理；2)固态发酵基质中加入了糯米，提高了霉菌产凝乳酶的活力；3)通过筛选合适的保护剂和载体，实现了喷雾干燥制备凝乳酶，回收率高。

【具体实施方式】

实施例1：

一种采用霉菌固态发酵生产凝乳酶的方法，所用霉菌筛选自江米酒酒醪，制备步骤为：

1)将霉菌在PDA培养基上培养3天后，以含有0.01％(m/v)吐温80的无菌水洗涤3次，收集孢子悬液，制备孢子含量为1.0×10⁶CUF/mL的孢子悬液；

2)在10个250mL三角瓶中，分别加入糯米7.5g，麸皮7.5g，加入含有葡萄糖2.8％(m/v)、Na₂SO₄ 0.031％(m/v)、吐温800.34％(m/v)、CaSO₄ 0.04％(m/v)、K₂SO₄ 0.04％(m/v)的营养液13.5mL，115℃灭菌20min，室温下冷却至30℃左右，分别接入1.5mL霉菌孢子悬液，30℃培养96h；