[发明专利]一种用于核酸特异识别检测的探针

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于核酸识别检测的新型探针。

背景技术

核酸聚合酶链式反应(PCR)技术被发明后，基因扩增和克隆变的越来越容易，该技术可以在1-3小时内特异地扩增靶核酸序列至几百万倍。现在，由于实时PCR仪的出现使普通PCR不再需要凝胶电泳分析，因此不必PCR后操作，PCR反应程序一旦马上就可以判断结果，同时也将PCR产物的污染可能性降到了最低，从而使实时PCR技术在临床上应用越来越广泛。

实时PCR核酸检测技术早期使用荧光染料，例如SYBR GREEN，EVE GREEN，指示PCR反应产物。染料法尽管简单，然而其无法识别非特异扩增，尤其是由于引物二聚体引起的非特扩增，虽然增加熔解曲线检测一步，但在实际应用中还是受到了很大限制。随后，实时PCR核酸检测技术中开始应用标记荧光基团的核酸片段作为指示探针，例如5’-核酸外切酶技术中使用的Taqman探针、分子信标、荧光能量转移探针(相邻探针)、蝎子引物、点亮探针等。实时PCR中加入探针对PCR扩增产物具有第二识别作用，从而避免了非特异扩增，结果更加可靠，也无需熔解曲线检测一步。不过，如前所述的探针普遍存在设计复杂，荧光本底高，对单碱基突变识别能力有限的缺点。

本发明涉及使用一种对核酸特异识别的实时检测的新式探针。该探针在设计思路上与前述的当前探针根本不同。此探针设计简单、易于合成、荧光本底低。本发明的探针检测技术是基于对靶核酸的置换杂交，该探针由2条核酸片段组成，第一条核酸片段的5端或3端标记有荧光基团，第二条核酸片段的5端或3端标记有淬灭基团，除去第一条链中间区域比第二条链有1～3个碱基多余外，2条核酸片段其他区域完全互补，因此在一定条件可形成双链结构，从而标记的荧光基团和淬灭剂能够充分靠近、淬灭荧光，所以在PCR退火时荧光本底低，而且双链结构中间多出1-3个碱基，此双链结构也很易于打开，因此对靶序列的杂交效率高。

发明内容

本发明涉及使用一种对核酸特异识别实时检测的新式探针。该探针为2条寡核苷酸组成，寡核苷酸的5’端和3’端分别标记有荧光基团或淬灭基团，2条寡核苷酸绝大多数碱基完全互补，除了第一条链中间区域比第二条多1-3个碱基，在一定条件下探针的2条链由于互补碱基而结合为双链结构，使探针形成一个带有凸环的二级结构，任何一条寡核苷酸的5端都可标记有荧光基团或荧光供体，而另一条3端标记有淬灭剂或者荧光受体。在一定条件下，探针的2条链杂交结合，形成一个带有凸环的结构，标记的荧光基团和淬灭剂能够充分靠近、淬灭荧光，当探针与靶序列杂交时，探针的2条链分别被靶序列置换，凸环结构消失，探针被靶序列张开，荧光强度随之发生改变。合适条件下，该探针不仅可以与它完全互补的靶序列结合；而且一定设计的探针只要靶序列里含有一个碱基的突变，该探针仍然能够保持凸环的二级结构，不与靶序列杂交。根据此，本发明的探针可以被用于实时PCR中靶核酸的检测。

所述的第一条链的中间区域，为寡核苷酸链中间碱基±5个碱基区域，最佳地，为寡核苷酸链中间碱基±2个碱基区域。

本发明的探针所使用的核苷酸可以是DNA，RNA，LNA，或PNA，或任何非自然核苷组成。

本发明还涉及到凸环探针技术的应用。

积极效果：

设计简单：凸环探针设计时没有太多要求，探针序列为扩增靶序列的一部分，只要探针其中的一条链中间区域有比第二条链多余的1-3个碱基即可。Tm值与相应的PCR反应体系中的引物或使用的退火温度保持一致或高出。任何设计过PCR引物的人员都可以设计。

荧光淬灭效率高：荧光报告基团和淬灭基团非常靠近，淬灭效果佳。

对靶序列核酸组成耐受性强：对于目前现存的荧光探针而言，其对于AT富集区和GC富集区的困难模板，有着很好的应用性。

合成方便简单：无需任何特别的仪器，只需普通的DNA合成仪即可完成合成。

特异性高：由于本探针存在一个自身的互补双链结构，只有当靶序列与探针第一条链的结合力大与第二条链结合的能量，探针才可以与靶序列发生杂交，放出荧光信号。如果与靶序列中存在突变，如单碱基的改变，突变识别的位置在第一条链的中间位置，该探针可以保持自身环形结构的稳定。另外，由于自身存在一个互补双链结构，设计时可以调节互补区域的长短，来调整探针的特异性。

和普通互补双链探针相比，优点在于：