[发明专利]生物转化制备4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重要的活性物质前体4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的生物转化制备的方法，属于生物转化技术领域。

背景技术

莱菔硫烷(sulforaphane)是迄今为止从蔬菜中发现的最具抗癌活性的化合物，大量研究证明，莱菔硫烷对食道癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌及大肠癌等都有很好的预防效果。其前体物4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷主要存在于十字花科蔬菜西兰花种子当中。目前，莱菔硫烷主要是通过水解西兰花种子中的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷，然后经过分离纯化制备而得。

目前，4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷主要通过天然产物提取的方法获得：将十字花科植物西兰花种子高温灭酶，以沸水或醇水体系作回流提取溶剂，将提取液过滤蒸干得到硫代葡萄糖苷粗提物，制备高纯度硫代葡萄糖苷，可采用酸性氧化铝色谱柱、大孔强碱性阴离子交换树脂以及制备色谱等技术进一步除杂纯化。

在所有十字花科植物种子中，4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷在西兰花种子中含量最高，但西兰花种子价格比较昂贵，原料成本较高，严重限制工业化生产。莱菔子容易获得且价格低廉，其价格是西兰花种子的三十分之一。其主要硫甙4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷的侧链结构为直链烷基，与4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷结构相似，仅在3、4位相差一个C＝C。所以由4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷向4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的转化工艺将会大大减少生产莱菔硫烷的生产成本，可促进莱菔硫烷的工业化生产的实现。

现有技术中，已有一项美国专利7,371,419中报道，通过对从莱菔子中提取得到的4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷粗品进行化学合成催化加氢也生成了4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷，该方法使用的高压反应釜作为反应容器，钯碳等作为化学催化剂，并通入氢气，在高压环境下进行多次化学合成反应。由于4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷在高压下极易分解变质，导致催化效率波动范围较大，反应不稳定，重复性较差，且该反应对设备耐压耐热要求较高，能耗高，存在大量的副反应。

发明内容

本发明为克服上述缺点，提出采用生物催化生成4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法，取代原有化学催化。该方法工艺简单，反应条件温和，易于工业化生产。其反应式如下：

1：4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷

2：4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种生物转化制备4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法，所述方法包括：在以4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷为底物、以面包酵母、深红酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗头孢中的一种菌种的发酵产物为酶源的反应体系中，于温度25-35℃下进行生物转化，反应结束后转化液经分离纯化得到所述的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷；所述发酵产物为所用菌种经发酵获得的发酵液或湿菌体；可将湿菌体加入含有底物4-(甲基亚硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷底物的缓冲溶液中作为反应体系，或直接按需要量将底物加入发酵液中作为反应体系。

所述的微生物催化合成4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法，其特征在于所述菌种为面包酵母、深红酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗头孢。

所述发酵液或者湿菌体由如下方法制备得到：将面包酵母、深红酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗头孢其中一种接种至发酵培养基，于该菌体常规适宜生长温度下培养16～48小时后，得发酵液，将发酵液于5000r/min离心10分钟得到湿菌体。所述发酵培养基为常规适用于该菌种的液体发酵培养基。

所述反应体系中底物初始浓度为10-100mg/ml，发酵产物加入量以所含湿菌体的湿重计为50～400g/l。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重。

所述反应体系中添加有终浓度为10-100g/L的葡萄糖作为辅助底物，可以促进反应进行。

优选的，所述反应体系的溶剂为0.1M，pH8.0的磷酸盐缓冲液，将底物和湿菌体加入磷酸盐缓冲液中，作为反应体系。

所述对称还原反应的反应温度为25～35℃，反应时间为24～120小时，在此条件下所得的转化液进行液相色谱、质谱分析测定表明，转化产物主要组分4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖。

所述的具体实验方法如下：

(1)斜面培养：适用于所用菌种的斜面培养基接种该菌株，30℃斜面培养3～5天，作为斜面种子；