[发明专利]一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型及其构建方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型及其构建方法，属于肿瘤侵袭转移体外实验模型及其构建方法技术领域。

背景技术

在全球恶性肿瘤死亡率排序中，肝癌是位居第三位的疾病，在我国则位居第二位，过去二十年，肝癌临床、基础研究均取得长足进步，但肝癌的总体预后并无显著改善，其总体术后5年复发率依然高达61.5％，即使是小肝癌术后5年复发率也高达43.5％，转移和复发成为进一步提高肝癌治疗效果与预后的最大障碍，而肝癌转移复发的发生与癌细胞的生物学行为(黏附、运动、增殖、侵袭)、细胞外基质、机体免疫、肿瘤血管生成及靶器官性质等许多因素有关，传统的转移性人肝癌细胞系、动物模型以及单因素、单基因相关性分析模式已经无法满足肝癌侵袭转移分子病理机制的实验解析，且目前报道的大量转移相关基因、蛋白多来源于转移瘤和原发瘤的比较、癌与癌旁组织的比较、以及转移潜能不同细胞系之间的比较等，这些“果”之间的比较，忽略了转移的起步阶段及靶器官特异选择后期阶段的“过程”关键调控蛋白的筛查，因此探索和建立新型体外侵袭转移模型或转移研究体系成为肝癌转移新理论、新机制发现的保证。

理想的体外转移模型既能较好地模拟肿瘤的生存转移环境，也应有助于肿瘤细胞的恶性生物学行为的实验解析。在肝癌体外转移模型建立方面，复旦大学肝癌研究所进行了大量创造性的工作，先后建立了人肝癌裸小鼠移植模型(LTNM1-LTNM4)、人肝癌裸大鼠移植模型(LTNR1、LTNR2)，高转移人肝癌裸小鼠模型(LCI-D20)、转移潜能不同人肝癌细胞系(MHCC97L，MHCC97H，LM3，LM6)，上述转移模型被国内外学者大量研究应用，对肝癌转移复发分子机制的阐明起到积极的推动。但从肿瘤细胞生物特性来看，体外多次传代的二维贴壁培养易改变或丢失肿瘤细胞的某些表型特征、生物特性，我们的前期工作也显示三维状态下的肝癌细胞在形态结构、基因表达、蛋白分泌、成瘤转移等方面明显不同于两维的人肝癌细胞系，高转移人肝癌细胞MHCC97H置于RWV生物反应器与生物支架PLGA相结合的三维旋转培养体系中培养可形成转移性肝癌类组织体，其在组织形态结构、特征基因表达、蛋白分泌情况、动物成瘤及转移能力等方面具有更接近体内转移性肝癌实体瘤生长病理特征(专利申请号CN200910048099.1，专利公开号CN101508973)，优于目前常用的转移性人肝癌细胞模型，新型三维肝癌类组织模型建立无疑对肝癌转移研究观念更新带来可能。三维微重力体外旋转培养获得类组织模型与实体瘤生长特性更为接近，可再现肿瘤细胞自然状态和生存环境，而在三维状态下，将高转移MHCC97H细胞与靶器官肝组织块旋转混合培养，能理想地模拟出癌细胞从黏附、浸润、到镜下癌巢形成的全过程，且较动物模型更易获取各病理阶段组织标本以用于转移前期及后期关键蛋白分子的筛查，也更易在体外通过抑制剂或促进剂控制黏附、侵袭、转移的条件而不受动物个体差异带来的干扰，同时在临床抗转移药物的筛选与评估中也有更直接的意义。

临床大量实践表明，肝内播散与肺转移是肝癌转移最常见的两种形式，为构建宜于直接检测、观察肝癌肝侵袭转移过程的体外研究模型，本发明应用组织工程领域RWV生物反应器系统，利用其低剪切、微重力体外三维培养环境，将高转移潜能人肝癌细胞系与裸鼠肝组织块共同旋转培养，模拟出肝癌细胞从黏附、侵袭到肝内癌巢形成全过程，构建肝癌肝侵袭转移体外研究模型，用于肝癌肝侵袭转移过程病理改变分析及“过程”关键蛋白筛查，此类体外实验模型目前国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是构建一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型，该模型可较好模拟癌细胞从黏附、侵袭到肝内癌巢形成的病理全过程，解决三维状态下缺少理想肝癌侵袭转移实验模型问题及肝癌侵袭转移“过程”关键蛋白筛查缺少理想标本实验体系问题，有助于深入解析三维状态下肿瘤细胞侵袭转移恶性生物学特征的分子机制。

为了达到上述目的，本发明的技术方案提供一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型，其特征在于，由高转移人肝癌细胞MHCC97H和裸鼠肝组织块经三维旋转混合培养得到。

本发明还提供了上述体外肝癌肝侵袭转移实验模型的构建方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将DMEM/F12培养液、胎牛血清和青链霉素溶液以体积比为100∶10∶1的比例混合得到混合培养液；