[发明专利]基于生物条码的核酸纳米金生物传感器

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于生物条码的核酸纳米金生物传感器制备方法。

背景技术

自从PCR方法产生，传统的基因检测技术如Northern杂交法、Southern杂交法等逐渐被其取代，它对医学诊断系统产生了革命性的突破。但是PCR除了对靶核酸扩增过程复杂耗时外，对扩增后核酸的定量方法也较狭窄，虽然后期发展的荧光定量PCR能很好的解决靶核酸的定量问题，但是它通常需要昂贵的试剂及仪器，而且要求专业技术的人员进行，而且容易污染，费时费力。

近年来出现的生物条码技术以DNA碱基严格互补配对的特性为原理，通过生物条码将对低丰度靶核酸的检测转换到按比例扩增后的条码核酸上，从而越过了核酸扩增过程，而且通过纳米技术，将DNA结合到纳米金颗粒上构成纳米颗粒基因探针，通过与条码核酸之间的互补实现纳米颗粒的组装进一步放大生物信号，使其具有与传统PCR相当的灵敏度，而且由于不需要核酸扩展，避免了一些贵重仪器的使用，最后检测结果可以通过目测而达到，整个过程操作简便，不依靠任何仪器和专业技术人员，在很短时间内就能完成检测，非常适合做基层检测及大规模流行病学筛查。

发明内容

本发明提供一种用于基于生物条码检测核酸的高灵敏度纳米金生物传感器，通过微孔板和纳米金上的探针与靶核酸形成DNA夹心，将纳米金上的条码核酸固定与孔上，再通过DTT释放生物条码实现检测信号的转换与放大，然后通过核酸纳米金生物传感器检测条码信号而测定靶核酸浓度。

本发明所述的一种基于生物条码的核酸纳米金生物传感器，其包括：

用于富集、转换并放大靶核酸信号的核酸放大装置；

用于测定靶核酸浓度的核酸检测装置；以及

液体试剂；

所述核酸放大装置包括：微孔板，其上固定有第一寡核苷酸探针；以及纳米金颗粒，其上偶联有第二寡核苷酸探针和条码寡核苷酸；所述第一寡核苷酸探针与第二寡核苷酸探针分别与靶核酸的两端序列互补，以致通过第一寡核苷酸探针-靶核酸-第二寡核苷酸探针的核酸夹心方式将纳米金颗粒固定在所述微孔板上，再通过洗涤去除未与微孔板结合的纳米金颗粒，用二硫苏糖醇释放出偶联在纳米金颗粒上的条码寡核苷酸；

所述核酸检测装置包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记第三寡核苷酸探针，该第三寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的，该第三寡核苷酸探针包含与条码寡核苷酸一端互补的核苷酸序列；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，为第四寡核苷酸探针和第五寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针是用生物素标记并与链霉亲和素偶联形成的；其中，固定于靠近吸水纸一端的第四寡核苷酸探针形成质控线，第四寡核苷酸探针与第三寡核苷酸探针互补；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针第五寡核苷酸探针形成检测线，该第五寡核苷酸探针与条码寡核苷酸的另一端互补；

所述液体试剂包括：

用于裂解样品释放核酸的裂解缓冲液，其成分为：100mM Tris-HCl，pH 7.5、500mM LiCl、10mM EDTA、1％[w/v]十二烷基硫酸锂、5mM二硫苏糖醇、10U RNase抑制剂；

用于洗去微孔中未结合纳米金的洗涤液，其成分为：0.15M NaCl、0.01M磷酸缓冲液、0.1％SDS，pH 7.4；以及

用于释放结合在纳米金上条码核酸的转换液，包括：0.1M DTT、0.15MNaCl、0.01M磷酸缓冲液、0.1％SDS，pH 7.4。

根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，在所述核酸放大装置中，所述微孔板体积为100-1000mm³，板底包被第一寡核苷酸探针。

根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，在所述核酸放大装置中，所述寡核苷酸标记的纳米金颗粒的粒径在20-200nm之间。

根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，在所述核酸放大装置中，所述与靶核酸一端互补的第一寡核苷酸探针的长度为15-30nt，与靶核酸另一端互补的条码寡核苷酸的长度为20-40nt，两种核酸均在一端进行-SH修饰，第一寡核苷酸探针与条码寡核苷酸的浓度比例从1∶50到1∶200。

根据本发明所述的检测条码寡核苷酸的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，在所述核酸检测装置中，所述质控线与检测线相距3-10mm。