[发明专利]一个大豆MADS-box基因及其在花器官改造中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一个大豆MADS-box基因GmMADS1的应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

人们已经从处于不同进化地位的整个庞大的植物各类群中分离得到了大量的MADS-box基因，MADS-box基因在花发育中起着重要作用，无论是从营养生长向生殖生长的转换；还是在生殖生长的初始阶段，花分生组织决定基因启动花分生组织的发育；以及在生殖生长后期，花器官原基的发育中都发挥着重要的作用。

大豆作为重要的粮油作物，有关其花发育的研究还相对滞后。大豆花多，花器较小，花粉粘重，花朵开放时翼瓣和龙骨瓣紧紧包住雄蕊和柱头，花药和柱头不外露，异花间的风媒传粉等花器特点造成大豆异花传粉非常难，也使大豆杂种优势很难利用，如果能定向改变大豆的花器结构，使之更利于吸引传粉昆虫或有利于风媒传粉，这将大大降低不育系繁殖或杂交制种的成本，使大豆杂交种应用于大面积生产。Feng(2006)通过对LjCYC2的遗传操作，在百脉根中已经实现对花瓣的改造。对大豆这样的严格自花授粉作物而言，或许可以以基因操作为基础的分子设计，实现其传粉方式的改变。因此，弄清花发育的分子机制，进而为改造花器官提供基础，具有重要的理论和现实意义。本发明从大豆中克隆了1个与在花瓣位置和数目的确定性上发挥了重要的调控作用的基因GmMADS1，提出了利用该基因进行植物花器官改造的基因工程改良方法。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于公开大豆MADS-box基因GmMADS1在花器官改造中的基因工程应用，该基因可作为目的基因导入植物，改变植物的花型，以进行植物品种改良。

技术方案

本发明所提供的大豆MADS-box基因GmMADS1，其序列为：SEQ ID NO.1。

大豆MADS-box基因GmMADS1的基因工程应用，包括：

1)大豆MADS-box基因GmMADS1的克隆

根据大豆MADS-box基因GmMADS1的全长序列，设计两端引物：

上游引物：5′-GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3′

下游引物：5′-CAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3′

取大豆品种Jackson花和花芽的混合物，提取总RNA，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸2min，33个循环后，72℃10min，将PCR产物进行克隆至pMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的大豆MADS-box基因GmMADS1的cDNA序列SEQ ID NO.1；

2)植物表达载体的构建

根据大豆MADS-box基因GmMADS1的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物上引入BamHI限制性内切酶位点，下游引物引入SacI限制性内切酶位点(单下划线标示的是BamHI的酶切位点；双下划线标示的是SacI的酶切位点)：

上游引物：5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3

下游引物：5-AGAGCTCCAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3

以步骤1)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将GmMADS1的cDNA克隆至中间载体pMD18-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121；

3)转基因植株的获得

将步骤2)获得的表达载体转入农杆菌菌株LBA4404，进一步转入植物，对获得的转基因植株进行PCR，RT-PCR验证后进行植物的表型分析，获得将步骤2)获得的表达载体转入农杆菌菌株LBA4404，进一步转入烟草，对获得的转基因植株进行PCR，RT-PCR验证后进行植物的表型分析，获得的GmMADS1转基因植株提前开花、矮化，萼片、雄蕊和花瓣的数目增加，产生了萼片、雄蕊向花瓣的转变，出现子房状萼片、开裂的花瓣和弯曲的雄蕊，而且由于雄蕊弯曲和缩短，导致雄蕊无法触及雌蕊，而不能正常授粉；此外，GmMADS1转基因植株的花药不能正常开裂，花粉的活力降低，最终导致转基因植株育性下降甚至完全不育。

有益效果