[发明专利]一个大豆MADS-box基因及其在花器官改造中的应用

权利要求书

1.大豆MADS-box基因GmMADS1的基因工程应用，其序列为SEQ ID NO.1，包括：

1)大豆MADS-box基因GmMADS1的克隆

根据大豆MADS-box基因GmMADS1的全长序列，设计两端引物：

上游引物：5′-GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3′

下游引物：5′-CAAGGAAGAGGCTA GCTAGG-3′

取大豆品种Jackson花和花芽的混合物，提取总RNA，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸2min，33个循环后，72℃10min，将PCR产物进行克隆至pMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的大豆MADS-box基因GmMADS1的cDNA序列SEQ ID NO.1；

2)植物表达载体的构建

根据大豆MADS-box基因GmMADS1的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物上引入BamH I限制性内切酶位点，下游引物引入SacI限制性内切酶位点：

上游引物：5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3

下游引物：5-ACAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3

以步骤1)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将GmMADS1的cDNA克隆至中间载体pMD18-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121；

3)转基因植株的获得

将步骤2)获得的表达载体转入农杆菌菌株LBA4404，进一步转入烟草，对获得的转基因植株进行PCR，RT-PCR验证后进行植物的表型分析，获得的GmMADS1转基因植株提前开花、矮化，萼片、雄蕊和花瓣的数目增加，产生了萼片、雄蕊向花瓣的转变，出现子房状萼片、开裂的花瓣和弯曲的雄蕊，而且由于雄蕊弯曲和缩短，导致雄蕊无法触及雌蕊，而不能正常授粉；此外，GmMADS1转基因植株的花药不能正常开裂，花粉的活力降低，最终导致转基因植株育性下降。