[发明专利]一种重组抗栓肽突变体、制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及具有抗血小板聚集功效的抗栓肽突变体，还涉及它的克隆、表达以及分离纯化。

背景技术

心血管疾病已成为全球卫生保健和卫生资源的沉重负担，是第二次卫生革命的头号敌人。发现新型特效、低毒、非静脉注射类型的用于治疗溶栓和抗栓药物已成为国内外心脑血管血栓治疗药物研究领域内的重点和热点。Seymour等(J Bio Chem，1990，265(17)：10143)首先从北美水蛭中发现抗栓肽是一种较好的血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa拮抗剂。抗栓肽(decorsin)是一种由39个氨基酸组成的小肽，等电点4.58，分子量为4384(还原型)。随着分子生物学及基因工程技术的发展，人们对蛋白质及多肽类药物的研究开发已经逐步由克隆表达天然蛋白质发展到对天然蛋白质进行设计和修饰，以期达到提高天然蛋白质药物生理活性、稳定性，降低毒副作用的目的。

文献报道(J Bio Chem，1990，265(17)：10143)的抗栓肽的半抑制浓度IC₅₀为500nmol/L，完全抑制浓度≤2.5μmol/L。

发明内容

本发明公开了一种重组抗栓肽突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示序列，即其氨基酸序列如下：

Ala-Pro-Arg-Leu-Pro-Gln-Cys-Gln-Gly-Asp-Asp-Gln-Glu-Lys-Cys-Leu-Cys-Asn-Lys-Asp-Glu-Cys-Pro-Pro-Gly-Gln-Cys-Arg-Phe-Pro-Arg-Gly-Asp-Trp-Arg-Pro-Tyr-Cys-Glu它通过改变野生型抗栓肽(decorsin)第34位的丙氨酸为色氨酸、第35位的天冬氨酸为精氨酸得到。

本发明还公开了该突变体基因的获得、原核表达载体的构建以及该重组多肽的分离纯化方法。

本发明根据野生型抗栓肽的氨基酸序列，并结合大肠杆菌的偏好密码子，设计了将原来野生型抗栓肽第34位的丙氨酸为色氨酸，第35位的天冬氨酸为精氨酸，并设计了四条引物，经重叠PCR的方法获得目的编码序列。然后将获得的编码序列进行HindIII和Kpn I双酶切后克隆至大肠杆菌表达质粒pET32a，获得重组表达质粒pET32a-Mutation然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达，并经金属螯合亲和层析并结合蛋白酶酶切技术建立了分离纯化工艺。

本发明的重组抗栓肽突变体的制备方法，依次包括下列步骤：

a、采用序列重叠的方法进行PCR扩增获得抗栓肽突变体的基因，四个参与PCR的序列分别为：

P1：5’-AAA GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG GCA CCG CGT CTG CCG CAGTGC CAG GGT GA-3’

P3：5’-CTG CCG CAGTGC CAG GGT GAC GAC CAG GAAAAATGC CTG TGCAAC AAA GAC GAA TGC-3’

P4：5’--AGT CAC CAC GCG GGA AAC GGC ACT GAC CCG GCG GGC ATT CGTCTT TGT TGC ACA-3’

P2：5’--CCC AAG CTT TTA TTC GCA GTA CGG GTC CCA GTC ACC ACG CGGGAAACG G-3’

b、突变体基因以限制性内切酶HindIII及Kpn I进行双酶切后插入原核表达载体pET32a形成的表达质粒，转化大肠杆菌，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导基因表达；

c、工程菌发酵后离心收集菌体，超声破碎细菌，离心，收集细菌裂解液，用Ni金属螯合层析柱纯化产品，即得。

药理实验证明，本发明的抗栓肽突变体具有优异的抑制血小板聚集功能，下面是本发明的抗栓肽突变体的ADP诱导的抗血小板聚集抑制试验：