[发明专利]一种适用于宫颈组织micro RNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种适用于宫颈组织micro RNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法。

背景技术

宫颈癌是发病率仅次于乳腺癌的女性第二大的恶性肿瘤，大量的流行病学资料表明，高危人乳头状瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌及其癌前病变发病的必要条件，但是单一HPV感染并不足以引起宫颈上皮的恶性转化。微小RNA(micro RNA，简称miRNA)是生物体内源长度约为20-23个核苷酸的非编码小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。到目前为止，已报道有几千种miRNA存在于动物、植物、真菌等多细胞真核生物中，进化上高度保守。

许多研究证明，miRNA可以用以标记癌症，例如，美国俄亥俄州立大学的研究通过分析来自肺部、宫颈、胃部、前列腺、结肠和胰腺等处的癌细胞样品540份，发现了由过量表达的大部分miRNA组成的实体癌症miRNA信号。而对于编码蛋白的肿瘤抑制子和致癌基因，这些miRNA差异表达作用的靶目标会大量富集，这说明miRNA在实体肿瘤的癌症发病机理中发挥着重要的作用。提示其极有可能在HPV致宫颈癌的发生发展过程中发挥关键作用。近年来的研究已发现若干MicroRNA在宫颈癌中表达异常，因此利用实验生物学及生物信息学方法对与宫颈癌相关的MicroRNA进行研究是当前研究的热点之一。

要了解MicroRNA在基因调控中扮演的角色，很关键的一个方法就是迅速、准确地定量检测MicroRNA基因的表达。成熟的MicroRNA一般只有二十几个碱基，同族的MicroRNA之间通常只有一两个碱基的差别，而且绝大部分MicroRNA在细胞中的表达水平都比较低，这些特性给传统的印迹杂交(northern blot)，生物芯片技术(microarray)和RT-PCR等常规手段带来了极大的困难和挑战。随着PolyA RT-PCR技术、尤其是stem-loopRT-PCR技术的发展，实时荧光定量PCR(real-time PCR)已经成为目前MicroRNA定量检测的主要方法，该法不仅灵敏度高，样品消耗量少，能检测出低丰度靶MicroRNA，定量线性范围宽；而且可精确区分同一家族中序列高度同源的MicroRNA，能精确检测只有一个碱基差别的不同micro RNA的表达水平。但是实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上依赖于筛选适合的内参基因对数据进行校正和标准化，从而避免不同标本在RNA的产量、质量及逆转录效率上可能存在的差别。

以往对mRNA的研究证实，任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素作用下有范围的恒定。在其他类型的细胞中或实验因素作用下则是变化的，盲目地使用内参基因，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能引致错误甚至相反的结论。MicroRNA在细胞中的表达水平低仅占总RNA的0.01％，且其表达具有更大的组织特异性，所以选择合适的内参对目的MicroRNA的表达进行标准化就显得尤为重要。目前文献中用来作为MicroRNA QRT-PCR内参的分子主要有let-7a，MicroRNA-103a，MicroRNA-16，MicroRNA-191、MicroRNA-26b等和小分子RNA(RNU48、5S)，因所研究组织的不同其选择内参也不同。

到目前为止，对宫颈病变相关的特异性micro RNA的定量研究中多盲目的参照在其他肿瘤中使用过的内参分子(RNU48、5S、let-7a)，但对其在宫颈组织中表达的恒定性及其作为内参的适用性均未进行探究。

发明内容

本发明的发明目的，在于针对现有宫颈组织中特异性MicroRNA的定量研究中内参使用的研究效果上的缺陷，提出了一种适用于宫颈组织micro RNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法；运用本发明方法筛选并证实的内参分子，可避免不同宫颈组织标本在RNA的产量、质量及逆转录效率上可能存在的差别，更好的对实时荧光定量PCR检测的数据进行校正和标准化，提高研究的准确性及可靠性。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：

一种适用于宫颈组织micro RNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方法，其步骤为：

(1)利用MicroRNA芯片对人类MicroRNA探针进行筛选，选出在宫颈癌及宫颈正常组织表达恒定且表达丰度高的MicroRNA，作为候选的内参；

(2)分别选取正常宫颈上皮组织和癌变宫颈组织作为临床宫颈组织标本，用荧光定量PCR进行验证；