[发明专利]Canine-SLAM/Vero细胞系及构建方法

说明书

技术领域：

本发明提供了一种Canine-SLAM/Vero细胞系，本发明还提供了上述细胞系的构建方法，用于犬瘟热病毒野毒株的分离及其病原学的研究，属于生物工程技术领域。

背景技术：

犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)属于副粘病毒科麻疹病毒属的一种有囊膜的单股负链RNA病毒。近年来，伴随着生态环境的变化及动物和病毒的进化，CDV的自然感染宿主已由传统的犬科、鼬科及浣熊科扩展到了食肉目所有8个科及偶蹄目猪科、灵长目猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物，并且CDV自然感染的宿主范围还有不断扩大的趋势。

虽然犬瘟热病毒的宿主范围在不断扩大，但从患病动物中成功分离到犬瘟热野毒株一直比较困难，尤其是在犬瘟热发病的非急性期分离是极其不易的，严重制约着对犬瘟热病的深入研究。传统分离犬瘟热病毒的方法比较多，但都有其明显局限性。例如，将早期感染犬瘟热动物的病毒阳性组织研磨液上清与SPF犬的淋巴细胞、或SPF雪貂腹腔巨噬细胞、或丝裂原刺激的犬淋巴细胞、或犬肺泡巨噬细胞共培养分离到CDV野毒株，但获取这些细胞比较困难，并且有的要求SPF动物增加了实验的成本和操作要求；也有极少采用病料接种鸡胚绒毛尿囊膜成功分离到犬瘟热野毒株，但该种方法至少要在新鸡胚上盲传数周才会出现明显的CPE，并且盲传会导致病毒毒力下降，且利用该途径分离犬瘟热病毒的成本也比较高；目前低成本分离病毒的途径是利用组织培养分离法。在早期，Vero和MDCK被广泛用于分离CDV，但该方法至少要在细胞上盲传一个月才会出现CPE，且不是所有的毒株都会产生CPE，研究发现适应MDCK或Vero细胞系的CDV毒株的遗传特征会发生变化；经EB病毒刺激的来自狨猴B淋巴细胞的B95a系(B95-8)对CDV易感，但狨猴是一种濒临灭绝的动物，且该细胞可向外分泌EB病毒，从实验安全和成本上讲该细胞系也不是分离犬瘟热病毒的最佳选择。鉴于目前国内还多用传统的方法分离培养犬瘟热病毒，分离成功的几率小，且时间较长，成本高。所以尽快建立起方便、快速分离犬瘟热病毒的方法显得尤为重要。

SLAM是免疫球蛋白超家族CD2的成员，存在于所有激活的T细胞、B细胞和树突状细胞。目前SLAM已被证实是犬瘟热病毒的主要受体，其与犬瘟热病毒的组织嗜性和感染宿主有密切联系，研究表明SLAM的V结构域与CDV的膜蛋白H蛋白结合，随之引起融合蛋白(F蛋白)结构变化，从而使病毒囊膜与细胞膜融合，使病毒进入细胞。

发明内容：

本发明公开了一种Canine-SLAM/Vero细胞系，是一种稳定表达犬瘟热病毒受体的细胞系，能快速且敏感地分离出CDV野毒株，并且在接种病料后36-48h内就能出现CPE，用于犬瘟热病毒野毒株的分离、滴定及其病原学等多方面的研究。

本发明还提供了上述细胞系的构建方法，缩短了分毒时间，提高了病毒产量，稳定表达犬瘟热病毒的犬SLAM受体。

本发明的Canine-SLAM/Vero细胞系，其特征在于：

Vero细胞中转染含犬SLAM的真核表达载体，细胞表面稳定表达有犬瘟热病毒受体SLAM。

本发明上述细胞系的构建方法，技术解决方案如下：

无菌颈静脉采集犬瘟热阳性犬抗凝血，应用犬淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，通过PCR方法获得犬SLAM基因；构建pCAGGS-Neo/SLAM质粒；将构建的pCAGGS-Neo/SLAM表达盒转染到Vero细胞中，采用G418筛选稳定表达SLAM的细胞系——Canine-SLAM/Vero；利用间接免疫荧光法鉴定和检测SLAM在细胞膜表面的表达情况；最后利用Canine-SLAM/Vero分离不同动物源犬瘟热野毒株，并进行敏感性比较研究。

具体制备方法包括以下步骤：

1.犬外周血淋巴细胞的分离

无菌颈静脉采集犬瘟热阳性犬抗凝血，应用犬淋巴细胞分离液按说明书操作分离外周血淋巴细胞；

2.犬SLAM基因cDNA编码的RT-PCR扩增

按照经典总RNA提取试剂盒说明书操作提取犬外周血淋巴细胞的总mRNA，应用Random Primer(6 mer)pd(N)6、Oligo d(T)15反转录引物合成cDNA后，用引物对SLAM-F/SLAM-R扩增犬SLAM基因；

上游引物SLAM-F：5’-GCCTCGAGACAGGTGAGAGCTTGATGAAT-3’(Xho I)

下游引物SLAM-R：5’-GCAGATCTCAGCTCTCTGGGAACGTCAC-3’(Bgl II)；