[发明专利]黑麦草腥黑粉菌检测标准分子及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种口岸检验检疫、农业生产、植物保护领域检测用的标准分子，特别是涉及一种黑麦草腥黑粉菌检测用标准分子及其制备方法。

背景技术

黑麦草腥黑粉菌(Tilletia walkeri Castebury&Carris)是一种与小麦印度腥黑穗病菌在形态特征上极为相似的真菌，主要为害黑麦草。该菌分布于美国、澳大利亚、新西兰、加拿大、丹麦、荷兰、日本、西班牙等地，我国尚未有报道。黑麦草腥黑粉菌于1996年在美国农业部展开的对小麦印度腥黑穗病菌的大普查中于美国俄勒冈州和东南部诸州的小麦种子洗涤液中首次发现，1999年Castlebury等根据其在形态特征上及生物学上与小麦印度腥黑穗病菌的微弱差别进行鉴定，并将其命名。该菌与小麦印度腥黑穗病菌形态学特征和分子学特征都十分相似，并且在实验室人工接种条件下可侵染小麦(Mathre et al，2000)。

黑麦草腥黑粉菌与小麦印度腥黑穗病菌冬孢子在大小和颜色上较为接近，只是前者的孢子外壁纹饰比较粗，孢壁具有脑纹结构(Castlebury etal.，1997)。章桂明等对小麦印度腥黑穗病菌及其近似种的冬孢子的形态特征在扫描电镜下进行了比较，认为两者形态学特征非常接近，只获得少量孢子的情况下难以从形态学方面将两菌进行区别，需要较多的孢子综合分析才能得出结论(章桂明，1999)。

在分子生物学方面，Larocthe等应用AFLP方法来区别小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌，建立了区别小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌的AFLP方法(Larocthe et al.，1997)。Pimentel等利用RAPD和PCR-RFLP的分析方法研究了黑麦草腥黑粉菌及其近似种，结果表明黑麦草腥黑粉菌的特有酶切位点是Sca I，它与小麦印度腥黑穗病菌之间的相似性达到85％；而RAPD方法的研究结果则显示当软件的支持率为100％时，这两种菌之间仅有25％的相似性(Pimentel et al.，1998)。McDonald等利用rep-PCR基因指纹技术对黑麦草腥黑粉菌及其近似种的基因组DNA进行了分析，得到其基因组指纹图谱，通过GeCompar(4.0)软件分析成功的将黑麦草腥黑粉菌和小麦印度腥黑穗病菌及其它近似种和相关种区分开(McDonald et al.，2000)。上述检测方法由于对实验操作要求比较高，而且重复性差，在实际操作中难以推广应用。因此Frederick等在Ferreira研究的基础上进一步分析了小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌2.3kb的线粒体DNA，并设计了扩增扩增黑麦草腥黑粉病菌的3对特异性引物，建立了黑麦草腥黑粉病菌常规PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法(Frederick et al.，2000)。程颖慧等对2.3kb的线粒体序列分析，分别设计了扩增小麦印度腥黑穗病菌的4对特异性引物和扩增黑麦草腥黑粉菌的2对特异性引物，对ITS序列进行分析设计了扩增所有供试材料的通用引物，建立了两种菌的常规PCR检测方法、双重PCR的检测技术、单孢PCR的检测方法、实时单色荧光PCR检测方法以及小麦印度腥黑穗病菌的实时双色荧光PCR检测方法(程颖慧等，2002)；易建平等对ITS序列进行分析设计了扩增所有供试材料的通用引物，利用套式PCR检测方法对冬孢子进行检测，建立了黑麦草腥黑粉菌的套式PCR检测方法(易建平等，2003)。章桂明等(2005)对黑麦草腥黑粉菌和小麦印度腥黑穗病菌分子检测方法进行研究，并在上述基础上制定了黑麦草腥黑粉菌实时荧光PCR检测方法国家标准。

分子生物学检测方法在实际检测过程中需要阳性参考物质作为对照，用以实验结果的分析和判定，确保实验结果的可靠性。现阶段黑麦草腥黑粉菌分子检测所用的阳性参考物质通常是其基因组DNA。但基因组DNA获取过程较复杂，制备非常不方便，其稳定性也尚不能满足长期及经常性使用的需要，并且由于不同检测实验室间使用的基因组DNA来源不同，提取质量存在差异，使得不同实验室的检测结果缺乏可比性和重复性，从而制约了黑麦草腥黑粉菌检测标准及其它分子检测方法的推广应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种制备简便、特异性强、具有良好均匀性和稳定性的黑麦草腥黑粉菌检测标准分子。

本发明的另一目的在于提供上述标准分子的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述标准分子的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：