[发明专利]黑麦草腥黑粉菌检测标准分子及其构建方法

权利要求书

1.一种黑麦草腥黑粉菌检测的标准分子，其特征在于：所述标准分子为能够进行复制的质粒，且所述质粒含有以下序列A和序列B中的至少一种，

所述序列A为Seq ID No.1所示序列；

所述序列B为Seq ID No.2所示序列。

2.根据权利要求1所述的标准分子，其特征在于：所述序列A为SeqID No.1所示序列与Genebank中编号为AF218061的黑麦草腥黑粉菌2.3kb序列99.65％同源；所述序列B为Seq ID No.2所示序列与编号为AF399887的黑麦草腥黑粉菌ITS序列100％同源。

3.根据权利要求1～2任意一项所述的标准分子，其特征在于：所述质粒为T载体。

4.根据权利要求3所述的标准分子，其特征在于：所述T载体为pMD19-T。

5.权利要求1～4任意一项所述的黑麦草腥黑粉菌检测标准分子的制备方法，所述方法包括：以黑麦草腥黑粉菌DNA为模板进行常规PCR扩增，所述PCR扩增的引物包括下述引物对a和引物对b中的至少一对，将扩增得到的DNA序列转化质粒，

引物对a：

Seq ID No.3：5′-TGGGCTGAGTCTGAGATGC-3′

Seq ID No.4：5′-AGTAATACCTGCGTCTCATAGC-3′

引物对b：

Seq ID No.5：5′-TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

Seq ID No.6：5′-GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：采用所述引物对a和引物对b分别进行PCR扩增，将引物对a扩增得到的片段与pMD19-T载体进行连接，将连接后得到的重组子以及引物对b扩增得到的片段分别用限制性内切酶XbaI和KpnI进行双酶切，分别回收酶切产物的大片段，将回收的片段进行连接。

7.权利要求1～4任意一项所述的黑麦草腥黑粉菌检测标准分子的检测方法，所述方法包括，利用特异性检测引物和探针，以所述标准分子为模板进行实时荧光PCR反应，并且所述探针5′端和3′端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

所述特异性检测引物分别含有Seq ID No.7和Seq ID No.8所示的序列，探针含有Seq ID No.9所示的序列：

Seq ID No.7：5′-CTCGAGCCACTCCGTTGG-3′

Seq ID No.8：5′-GACAACTCCAGTGATGGCTCC-3′

Seq ID No.9：5′-TACTCTTCATTGCCCTCA-3′