[发明专利]一种高效表达抗菌肽饵料藻的构建技术与应用方法

说明书

技术领域

本发明申请涉及一种能够高效表达抗菌肽基因的载体的构建方法，以及由此方法得到的表达载体、转化体以及能够高效表达抗菌肽的转基因藻及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

抗菌肽(antibacterial peptide)最初是从免疫后的昆虫血淋巴细胞中发现的一类活性多肽，是一类由20～60个氨基酸组成的活性肽类物质，通常含有2～3个带正电荷的氨基酸，如精氨酸或赖氨酸，因此又称阳性抗菌肽。抗菌肽是一种具有双亲性质结构的物质，分子中的疏水部分一般位于C端，而阳离子氨基酸部分位于N端，而且所有抗菌肽的C末端都是酰胺化的。它的分子量一般在几千个道尔顿(Da)之间，具有水溶性好，不易被酶水解，热稳定性高等特点。一般的抗菌肽都具有广谱的抗菌性，对真菌、原生生物也能起一定的抵抗作用，有一些特殊的抗菌肽还能杀死病毒和肿瘤细胞。抗菌肽杀菌具有高效性，在浓度很低的情况下就可以发挥作用，其最小抑菌浓度一般为0.25～4μg/ml。

1975年瑞典科学家G.Boman等将蜡状芽孢杆菌诱导惜古比天蚕(Hylophoracecropia)产生一种新的肽类物质，命名为天蚕素(cecropins)，这是第一个被发现的抗菌肽。此后，人们又在细菌、真菌、两栖类、哺乳动物、植物和人类中相继发现并分离得到了多种抗菌肽，迄今为止，已经在自然界中发现了1700多种抗菌肽。近年来的研究表明，抗菌肽具有不同于一般抗生素的特殊作用机制，使细菌不容易产生耐药性，有望成为新一代抗菌药物。天蚕素Cecropin B是一种从家蚕中分离得到的昆虫抗菌肽，具有分子量小、热稳定性好、水溶性好、广谱抗菌等优点，更为重要的是Cecropin B对真核细胞几乎没有作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，是目前已知天然抗菌肽中活力最强的一种。

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)属于绿藻门、团藻目、衣藻科，是一种单细胞真核鞭毛藻类，是研究多种生命活动(如光合作用、鞭毛组装、趋光性和生理节律等)的模式生物，与酵母细胞有许多共同的特征，素有“光合酵母”之称。它的遗传背景清楚，其基因组学研究已近完成，是目前唯一建立细胞核、叶绿体和线粒体三套遗传转化系统的生物材料。由于其生长速度快、光合效率高、可进行基因定点整合，是最适合构建转基因光合生物反应器的单细胞真核生物，具有非常广阔的应用前景。

目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽具有抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生耐药性、靶菌株不易产生抗性突变和对动植物无毒副作用等特点，其作为理想的抗生素替代品，正受到人们越来越多的重视，在养殖业、医药工业上有着广阔的应用前景。抗菌肽的表达在大肠杆菌和酵母细胞中已经存在，特别是在酵母细胞中有较好的表达效果，但还未有在莱茵衣藻中表达抗菌肽的报道。

发明内容

本发明目的是提供一种能够在莱茵衣藻内高效表达天蚕素B基因的表达载体，以及经过该表达载体转化得到的转化子，由于经转化得到的转基因莱茵衣藻能够高效表达天蚕素B，所以可以作为活体饵料，也可以应用于动物饲料添加剂、生物制药、保健品研制等领域。

本发明是通过以下方法实现的：

一种高效表达抗菌肽饵料藻的构建技术，其特征在于：将人工合成的含连接肽序列的串联抗菌肽基因导入受体藻株中，经筛选得到能高效表达抗菌肽的转基因藻，此方法包括以下步骤：

1)转基因受体藻的筛选与培养：选用饵料藻(如底栖硅藻、小球藻、莱茵衣藻等)作为转基因受体藻株，具有生长迅速、易培养等特点。采用藻类特定培养基(如BBM、BG-11和TAP等)，在光照90～200μE/m².s的条件下通气培养；

2)抗菌肽基因的合成：a、根据抗菌肽基因序列(如Cecropin B等)和受体藻基因组偏爱密码子表，设计适合于藻类表达的抗菌肽序列，并通过人工合成的方法合成抗菌肽基因。b、利用连接肽序列将抗菌肽基因串联组合，形成含连接肽序列的串联抗菌肽基因；

3)藻类抗菌肽表达载体的构建：将串联抗菌肽基因(如串联CecropinB，4个串联)插入藻类表达载体(如莱茵衣藻pH105载体的Nhe I和Pmac I位点)，获得抗菌肽基因表达框架，然后分别将抗菌肽基因表达框架插入带筛选标记表达盒的载体(如莱茵衣藻pSP124的EcoR I位点)，获得带筛选标记的抗菌肽基因衣藻核表达载体；