[发明专利]一种高效表达抗菌肽饵料藻的构建技术与应用方法

权利要求书

1.一种在藻类中高效表达抗菌肽的载体构建方法，其特征在于：此方法包括以下步骤：

1)根据抗菌肽基因序列和受体藻基因组偏爱的密码子表，设计合成适合于藻类表达的抗菌肽基因序列；

2)利用连接肽序列将抗菌肽基因串联组合，形成含连接肽序列的串联抗菌肽基因；

3)将串联抗菌肽基因插入含有藻类启动子和终止子的表达载体，获得抗菌肽基因表达框架；

4)将抗菌肽基因表达框架插入带筛选标记表达盒的载体中，获得带筛选标记的抗菌肽基因的表达载体。

2.如权利要求1所述的在藻类中高效表达抗菌肽的载体构建方法，其特征在于：在莱茵衣藻中表达抗菌肽Cecropin B基因的表达载体构建方法包括以下步骤：

1)根据莱茵衣藻基因组偏爱的密码子，设计合成适合于莱茵衣藻表达的天蚕素Cecropin B基因序列；

1)将四段相同的Cecropin B基因依次串联起来，中间加上了莱茵衣藻的自剪切连接肽序列LWMRFA，末尾加上His6标签，两端设计了Nhe I、Sal I限制性内切酶，总基因长度为522bp；

2)将串联CecropinB基因连接到含有hsp70-RBCS2启动子和RBCS2终止子的pH105载体上，构建载体pCB105，获得天蚕素CecropinB基因表达框架；

3)用限制性内切酶Nhe I、Sal I将pCB105上的天蚕素CecropinB基因表达框架切下，连接到含有ble筛选基因的载体pSP124上，构建最终的衣藻表达载体pCB124。

3.一种高效表达抗菌肽转基因藻的构建技术，其特征在于：将人工合成的含连接肽序列的串联抗菌肽基因导入受体藻株中，经筛选得到能高效表达抗菌肽的转基因藻，此方法包括以下步骤：

1)转基因受体藻的筛选与培养：选用饵料藻作为转基因受体藻株，具有生长迅速、易培养等特点，采用藻类特定培养基，在光照90～200μE/m².s的条件下通气培养；

2)抗菌肽基因的合成：a、根据抗菌肽基因序列和受体藻基因组偏爱密码子表，设计适合于藻类表达的抗菌肽序列，并通过人工合成的方法合成抗菌肽基因；b、利用连接肽序列将抗菌肽基因串联组合，形成含连接肽序列的串联抗菌肽基因；

3)藻类抗菌肽表达载体的构建：将串联抗菌肽基因插入藻类表达载体，获得抗菌肽基因表达框架，然后分别将抗菌肽基因表达框架插入带筛选标记表达盒的载体，获得带筛选标记的抗菌肽基因表达载体；

4)抗菌肽基因表达载体的遗传转化与转基因藻的筛选：分别将抗菌肽基因表达载体，通过“珠磨法”、基因枪法或电击转化法进行遗传转化，通过抗性平板筛选或营养缺陷型筛选，获得阳性藻落，进行分子检测和表达产物分析，确定高效表达抗菌肽的转基因藻。