[发明专利]一种广谱性农药残留免疫检测试纸及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于农药残留的检测试纸及其制备方法和应用，尤其是一种可用于检测多种有机磷和多种拟除虫菊酯类农药残留的免疫检测试纸及其制备方法和应用。

背景技术

农药是当前农业生产用于防治病、虫、杂草对农作物危害不可缺少的物质，对促进农业增产有极重要的作用，但同时带来严重的环境问题：生态失衡，农产品品质下降，人类身体健康受威胁。目前，有机磷、拟除虫菊酯农药具有高效的杀虫效果，是植物化学保护的主力军。随着近年来环境保护的呼声越来越高，有机磷、拟除虫菊酯农药使用带来的环境问题日益引起人们的重视。

但就目前的形势而言，人类仍面临饥饿，贫穷的困扰，全面禁止农药的使用是不现实的，为了达到高产、高效的目标，农药的地位在短期内是无法取代的。鉴于此，为保障人民的身体健康，有效控制生产中农药的合理使用和对其残留量进行监控，开发一种快速、可靠、灵敏，适于农药残留现场监控的痕量分析方法具有重要的现实意义。目前有机磷、菊酯类农药的残留分析方法主要是复杂的前处理过程，再配以高效HPLC或GC(带ECD)，这种检测方法费用相对昂贵，且须技术熟练的操作人员。免疫分析是一种快速、灵敏的用于痕量检测的方法，但农药多为小分子化合物，免疫原合成难度较大，又由于抗体有特异性，建立的免疫分析方法多只适用于单一农药残留量的检测分析，限制了免疫分析方法的应用，另现行的免疫分析多以聚苯乙烯酶标板为固相载体，检测结果一般需要3-8h，检测过程复杂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有广谱性标记抗体的免疫检测试纸及其制备方法和应用。具有测定速度快、不需要特殊仪器设备的特点。

为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案：

一种广谱性农药残留免疫检测试纸，该试纸采用含有对多种有机磷和多种拟除虫菊酯类杀虫剂有特异性识别的单克隆或多克隆抗体的硝酸纤维素膜试纸。

所述的多种有机磷或多种拟除虫菊酯类杀虫剂有特异性识别的单克隆抗体是以有机磷或菊酯类农药通用结构为半抗原，通过活化酯法合成免疫原，免疫BALB/C小鼠，每只小鼠100μg免疫原，与等体积氟氏完全佐剂混合乳化均匀，沿腹股沟注入腹腔膜内；4周后，加强免疫，剂量不变，佐剂改为氟氏不完全佐剂；加强免疫三次后，采血测小鼠效价，待血清效价不再上升时，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞按5-10∶1的比例混合于50ml离心管进行融合，融合后的细胞经培养后待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，取细胞培养上清液用酶联免疫检测，每次检测均为复孔检测，在每次检测后的第二天重复检测，以确证结果；将强阳性孔内的细胞用有限稀释法进行克隆培养，并跟踪记录，经过3次以上的克隆培养和检测，均为阳性的孔内的细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；经过扩大培养后用来制备腹水；提前一周用0.5ml石蜡油注射小鼠腹腔，将10⁶个杂交瘤细胞悬浮在1ml无血清培养基中，注入小鼠腹腔内；10天后，小鼠腹部明显膨大，收集腹水；用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化单克隆抗体。

所述的多种有机磷和多种拟除虫菊酯类杀虫剂有特异性识别的多克隆抗体是以有机磷或菊酯类农药通用结构为半抗原，通过活化酯法合成免疫原，免疫新西兰大白兔，当效价达最佳时，心脏采血，先用硫酸铵分步沉淀法初步纯化后，再经Sephadex G-200进一步纯化得到的高质量广谱性有机磷抗体或拟除虫菊酯抗体。

一种广谱性农药残留免疫检测试纸的制备方法，其制备方法包括如下步骤：

1)首先采用由2×2块0.5cm×0.5cm大小的硝酸纤维素膜(NCM)，并将其每块分别取名为A1，A2，B1和B2；

2)、然后将1μL有机磷包被液点滴于A1，A2中央，1μL拟除虫菊酯包被液点滴于B1，B2中央，下面垫吸水纸，4℃过夜，于PBST漂洗3次，晾干；

3)、再是将经过步骤2)处理后的4块硝酸纤维素膜分别浸在封闭液中浸泡30min，于PBST中漂洗3次，晾干；

4)、其次是将经过步骤3)处理后的A1、B1浸在有机磷抗体、拟除虫菊酯抗体和待测样品提取液的预混合液中；A2、B2浸在有机磷抗体、拟除虫菊酯抗体和阴性样品提取液的预混合液中，作为对照样，10min后于PBST中漂洗3次，晾干；

5)、然后再将经过步骤4)处理后的4块硝酸纤维素膜分别浸在酶标二抗稀释液中10min，于PBST中漂洗3次，晾干；

6)、再将经过步骤5)处理后的4块硝酸纤维素膜分别浸在底物反应液暗处反应5min，于PBST中漂洗3次，晾干；