[发明专利]一种甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

流感病毒分为甲、乙、丙三型，甲型流感病毒最容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。流感甲型病毒的表面抗原会经常发生细小变异，即病毒通过细小的变化伪装自己，从而达到躲避人体免疫系统识别的目的。甲型病毒变异的结果是每年引发流感的毒株都有可能不同，人们每年都需要重新接种流感疫苗进行预防，往往会导致流感的全球性大暴发。

甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为15个亚型(H1～H15)，N有9个亚型(N1～N9)。其中仅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株。一般情况下，禽流感病毒不会感染鸟类和猪以外的动物。但1997年香港首次报道发生18例H5N1人禽流感感染病例，其中6例死亡，引起全球广泛关注。1997年以后，世界上又先后几次发生了禽流感病毒感染人的事件。具有高致病性的H5N1、H7N7、H9N2、等禽流感病毒，一旦发生变异而具有人与人的传播能力，会导致人间禽流感流行，预示着禽流感病毒对人类已具有很大的潜在威胁。

同许多其它的呼吸系统病毒性疾病相似，流感也是一种季节性疾病，夏季的发病率较低，冬季的发病率较高。同时发病时间与地理位置有关，北半球通常在1～2月份达到高峰，南半球的流行通常在5～9月。

流感发病严重程度与个体免疫状况有关，一般说来，仅约50％的感染病人会发展成典型流感临床症状。流感典型症状以突然发热、头晕头痛、肌痛、全身症状轻、同时可伴有喉咙痛和咳嗽、鼻塞、流涕、胸痛、眼痛、畏光等症状。发热体温可达39～40℃，一般持续2～3d后渐退。一般是全身症状较重而呼吸道症状并不严重。其最常见的并发症是继发性细菌性肺炎。

预防流感，除接种流感疫苗外，还需注意保持个人卫生，养成良好的个人卫生习惯；居室和办公室，都要经常通风，减少室内聚集的细菌和病毒数，保持室内清新的空气；疾病流行期应尽量避免到公共场所，比如商场、电影院等人群密集的地方；要加强体育锻炼，经常坚持户外运动，以增强身体抵抗力。

近年来的发展起来针对甲型流感病毒的荧光定量PCR(Fluorescence QuantitativePCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高，速度快，特异性强等优点在甲型流感病毒的基因检测水平上有着广泛的应用，是目前甲型流感检测的主要方法，目前国内市场上已经有了关于甲型流感核酸定量检测试剂盒。

FQ-PCR虽然有着简便，快速，灵敏的优势，但是其检测需要昂贵的仪器，且容易造成假阳性等问题。

交叉引物扩增法是一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计6种(三对)特异引物，引物尾端交叉互换序列，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、多次温度循环等过程，此交叉引物恒温扩增靶核苷酸序列的方法及其应用本申请人之前已申请专利(申请号：200810134583.1)。在此方法的基础上制备了本发明的甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒特异性好，灵敏度高，步骤简单，反应速度快。

本发明所提供的甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒，包括下列组成：

(1)RNA提取液：RNA提取试剂盒；

(2)恒温扩增反应液：

包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermolbuffer、MgSO₄、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：

所述的外围引物分别为：

正向外围引物序列为5’-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’(SEQ ID NO1)；

反向外围引物序列为5’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’(SEQ ID NO2)；

所述的两条探针的序列分别为：

正向5’端Biotin标记探针5’-biotin-CATGGAATGGCTAAAGACAA-3’(SEQ IDNO3)；

反向3’端异硫氰酸荧光素FitC标记探针5’-CCTTAGTCAGAGGTGACAAG-FitC-3’(SEQ ID NO4)；

所述的扩增交叉引物分别为：