[发明专利]一种甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：包括下列组成：

(1)RNA提取液：RNA提取试剂盒；

(2)恒温扩增反应液：

包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermolbuffer、MgSO₄、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：

所述的外围引物分别为：

正向外围引物序列为5’-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’，SEQ ID NO1；

反向外围引物序列为5’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’，SEQ ID NO2；

所述的两条探针的序列分别为：

正向5’端Biotin标记探针5’-biotin-CATGGAATGGCTAAAGACAA-3’，SEQ IDNO3；

反向3’端异硫氰酸荧光素FitC标记探针5’-CCTTAGTCAGAGGTGACAAG -FitC-3’，SEQ ID NO4；

所述的扩增交叉引物分别为：

扩增反向引物5’-CTATCATCCCGTCAGGCCCACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’，SEQ ID NO5；

扩增正向引物5’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAGCTATCATCCCGTCAGGCCC-3’，SEQ ID NO6；

(3)阳性对照模板：为含有含有甲型流感HA基因片段的转录产物；

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

2.根据权利要求1所述的甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述的恒温扩增反应液中1×Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。

3.根据权利要求1所述的甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照为为含有长232bp的甲型流感病毒MP基因序列，序列如下：TTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTTTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAGACTGGAAAGTGTCTTTGCAGGAAAGAACACAGATCTTGAGGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGGGAATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGT SEQ ID NO7。

4.根据权利要求1所述的甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照通过下列步骤制备：

利用一条外围引物和带有T7启动子的另一条外围引物以甲型H1N1病毒的基因组RNA模板进行RT-PCR扩增获得目的基因；用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物转录出目的的RNA片段，用分光光度计测A₂₈₀定量并稀释至10⁶拷贝/μl，-20℃保存。

5.一种应用权利要求1试剂盒的甲型流感病毒核酸恒温扩增定性检测方法，包括如下步骤：

(1)用RNA提取试剂盒从待检测的标本中提取RNA；

(2)将步骤(1)提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在60℃下扩增反应90分钟；对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板；

(3)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有甲型流感病毒核酸。

6.根据权利要求5所述的甲型流感病毒的恒温扩增检测方法，其特征在于：所述的反应液中两条外围引物为0.05μmol，两条探针为0.5μmol，两条交叉引物为0.5μmol，MgSO₄为6mmol，dNTPs溶液为0.4mmol，Bst DNA聚合酶为10U。

7.根据权利要求6所述的甲型流感病毒的恒温扩增检测方法，其特征在于：标本RNA 4μl，总反应液16μl。