[发明专利]一种沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

沙门氏菌，属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。沙门氏菌病是公共卫生病学上具有重要意义的人畜共患病之一，是主要的肠道致病菌之一，易引起食物中毒，人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。在我国，以沙门氏菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的首位。沙门氏菌通常是通过摄取受到动物粪便污染的食物进入人的体内。而一般容易受污染的食品主要是动物性食品，如牛肉、禽肉、牛奶、鸡蛋及其制品等，食品也可能被已感染沙门氏菌的食品加工人员污染。受到沙门氏菌污染的食物在外形与味觉上与正常食物没什么两样，因此准确、快速地检测食品中的沙门氏菌具有十分重要的意义。

志贺氏菌属也是一类革兰氏阴性菌，形态与其它肠杆菌科的种类似，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌。人类对痢疾杆菌有很高的易感性在幼儿可引起急性中毒性菌痢死亡率甚高。据国内综合资料志贺氏菌属在我国感染性腹泻病原菌中居首位志贺氏菌既可通过水也可通过食品传播腹泻及痢疾等疾病。据报道国际上每年都有由志贺氏菌引起的疾病的暴发与流行根据WHO年度报告亚(不包括中国)非拉各洲仅小于5岁的儿童每人每年发生腹泻2.2次细菌性腹泻的病例多达1.5到2.5亿人，我国广大农村地区由于卫生条件差，经常有由于水源或食品受到志贺氏菌污染而引起痢疾腹泻等疾病流行的报道。因此，快速检测与鉴定水或食品中志贺氏菌不仅为及时有效地预防治疗和控制水或食源性传染病提供依据，同时也是保障人民身体健康的必要手段。

传统沙门氏菌，志贺氏菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(realtime PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)具有很多的优越性。

因此，需要一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的沙门氏菌的检测试剂盒及志贺氏菌的检测试剂盒及其使用方法以解决上述问题。

基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)快速检测沙门氏菌与志贺氏菌的方法，是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63～65℃)条件下45～90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2～3天，完成鉴定报告需10～15天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时。并且，本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。