[发明专利]一种检测人工抗原制备成功与否的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定人工抗原的方法，尤其是采用超高效液相色谱与四级杆电喷雾质谱联用法判断人工抗原是否制备出来的方法。   

背景技术

方便、简洁、快速和灵敏的分析技术和检测手段是保障食品安全和环境监测的重要保障。农药和兽药的不合理使用甚至滥用导致食用农产品药物残留超标，已成为食品安全的突出问题之一，开发可靠、灵敏、快速和实用的快速分析检测技术无疑是监测和控制残留、保障人民身体健康和避免国际间贸易争端的重要技术手段。免疫分析技术（IA）特别是酶联免疫吸附分析技术（ELISA）作为一项快速检测技术，以其抗原抗体反应的高专属性，测定方法简单、快速、灵敏度高、费用低和适于现场大批量样品筛选等优点，在农药兽药残留分析和环境检测中展示了广泛的应用前景。

免疫分析法是利用抗原和抗体的结合反应的检测方法，而大多数农药和兽药都是小分子物质（也叫半抗原，hapten），相对分子质量在1000Da以下，它缺乏Ｔ细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性的抗体，但把它以共价键方式偶联到大分子蛋白载体上制备成人工抗原(也称：偶联物)后，可借助其Ｔ细胞来间接诱导B细胞的增殖与分化，产生特异性的抗体，这也是小分子免疫分析的基本模式。在这项技术中，鉴定人工抗原（半抗原－载体蛋白偶联物）是否偶联制备成功是建立免疫分析方法的前提和关键。

目前人工抗原主要的鉴定方法有紫外分光光度法（UV）、红外分光光度法（IR）、SDS-page电泳法和基质辅助激光解吸飞行时间质谱法（MALDI-TOF）等。但这些方法的通用性不强，限制性条件较多。例如UV通过区别半抗原－载体蛋白偶联物（人工抗原）与载体蛋白的紫外吸收谱以鉴定人工抗原的合成，只有当半抗原与载体蛋白具有不同的发色团才可使用；如果人工抗原的纯化不完全，未反应的半抗原或其他小分子杂质势必会影响人工抗原的检测鉴定结果的可靠性；这种方法对不含紫外吸收基团的半抗原更是无能为力。IR的方法也存在类似的缺点。电泳技术是利用溶液中的离子在一定的电场作用下迁移从而达到分离的技术，电泳法在生物大分子的的鉴别中应用非常广泛；在人工抗原的鉴定中，目前主要应用的电泳法是SDS-聚丙烯酰胺电泳法、SDS-page电泳法，是通过比较人工抗原和其载体蛋白在凝胶上出现的条带位置的不同来判定人工抗原的合成是否成功；更确切的说就是根据人工抗原与载体蛋白的分子量的差异来判定；缺点在于如果载体偶联半抗原较少，使人工抗原的分子量增加不明显，使用SDS－page法表现在凝较上的条带位置差异就不明显；文献报道只有当分子量较大的半抗原（>800Da）与分子量较小的载体蛋白（<20000Da）偶联制备的人工抗原，运用此法鉴定才具有较好的鉴别效果；基质辅助激光解吸飞行时间质谱法（齐小花等．生物质谱法对人工抗原偶联比的快速测定．检验检疫科学，2007增刊）是目前最有效的人工抗原的鉴定方法，缺点是在待测样品的制备时需要选用适合离子化的基质，如果选择不当，会造成检测结果的重复性差；同时激光解吸飞行时间质谱仪器价格昂贵，操作条件较苛刻，不适合大规模推广应用。

由于人工抗原结构复杂，它是由小分子上的特定基团如氨基、羧基等通过特定的反应连接到载体蛋白如牛血清白蛋白、人血清白蛋白，卵清蛋白等特定的氨基酸残基上而制备成的，小分子与蛋白质蛋白的结合位点多，分析难度大，目前还缺乏一套通用性强的分析检测方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种新的、快速、有效及可靠的方法以判断人工抗原是否制备出来。

本发明的目的是这样实现的：

一种判断人工抗原是否制备出来的方法，该方法包括以下具体步骤：

a、分别称取相同重量的人工抗原及载体蛋白，加1～10重量倍溶剂溶解，超声1min，12000rpm离心后，取上清液，分别得到人工抗原测试样品及载体蛋白测试样品；

b、用超高效液相色谱四极杆电喷雾质谱联用仪分别对测试样品检测，分别得到超高效液相色谱图及四极杆电喷雾质谱图； 

c、比较所得人工抗原及载体蛋白的超高效液相色谱图及其相对应的质谱图的差异，确定人工抗原是否制备出来；

其中：用超高效液相色谱四极杆电喷雾质谱联用仪对测试样品检测时，其超高效液相色谱条件为：

流动相：

A相：乙腈

B相：体积比0.01∶100～0.1∶100的三氟乙酸水溶液

线性梯度：在0～10min A相 由10%～30%线性增加到70%～90%，相应的B相由70%～90%线性减少到30%～10%