[发明专利]精子特异性阳离子通道蛋白CatSper1的基因疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗，特别涉及精子特异性阳离子通道蛋白CatSper1的 基因疫苗，还涉及该疫苗的制备方法。

背景技术

以精子抗原为基础的疫苗开发代表了一种大有希望的避孕途径。精子抗原 在避孕疫苗开发上的应用在于其精子特异性，参与人类生育，并可在生殖道局 部产生足以能够终止受精的免疫应答。

CatSper1是精子特有的一种阳离子通道蛋白，特异性地表达于睾丸和附睾组 织上，主要定位于精子尾部的主段，对于精子超活化有重要的调节作用。基因 敲除试验表明，CatSper1基因缺失小鼠的精子运动力大大降低，不能穿过透明带 完好的卵，而且丧失受精能力。

B细胞激活因子(BAFF)是B细胞存活与成熟的必需因子，为肿瘤坏死因子 (TNF)家族成员。其能够增强B细胞、CD4T细胞、NK细胞的活性，使机体的免 疫应答增强；还可作为T细胞激活的共刺激因子，刺激T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ) 和白介素-2(IL-2)，上调CD25(IL-2受体α链)表达，并以IL-2依赖方式促进T细胞 增生。

免疫刺激复合物(ISCOM)是由抗原、皂苷Quil A、胆固醇及磷脂混合后自发 形成的一种直径为30～40nm的球形笼状颗粒，具有佐剂和抗原递呈的双重功能， 可大幅度提高抗原的免疫原性。文献报道，以ISCOM为佐剂制得的DNA疫苗 诱导的中和抗体水平和免疫保护力明显高于裸DNA，可能的机制是经ISCOM 包裹的DNA能免受体内核酸酶的降解，从而保证该DNA在机体内持续表达。 另外，ISCOM的结构特性使其更易于定居在淋巴组织内，从而有利于抗原递呈 细胞的吞噬。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种精子特异性阳离子通道蛋白 CatSper1的基因疫苗；目的之二在于提供所述精子特异性阳离子通道蛋白 CatSper1的基因疫苗的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、精子特异性阳离子通道蛋白CatSper1的基因疫苗，该疫苗是由CatSper1 和BAFF双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成的 ISCOM型疫苗。

进一步，所述CatSper1和BAFF双基因共表达重组真核载体是在含有内部 核糖体进入位点IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游和下游分别插入 CatSper1全长cDNA和BAFF全长cDNA；

进一步，所述CatSper1和BAFF双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、 胆固醇及卵磷脂的质量比为5∶10∶1∶1。

2、所述精子特异性阳离子通道蛋白CatSper1的基因疫苗的制备方法，包括 以下步骤：

a、CatSper1和BAFF双基因共表达重组真核载体的构建：将CatSper1全长 cDNA插入含有IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游，再将B细胞激活 因子全长cDNA插入该真核载体的IRES下游，即得CatSper1和B细胞激活因 子双基因共表达重组真核载体；

b、ISCOM的制备：将CatSper1和BAFF双基因共表达重组真核载体用磷 酸盐缓冲液即PBS溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫 升溶液中含有CatSper1和BAFF双基因共表达重组真核载体0.5mg、皂苷Quil A 1mg、胆固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再 用PBS透析，所得微絮状物即为形成的ISCOM，也即CatSper1的基因疫苗。

进一步，所述步骤a的具体方法为：

a1、CatSper1全长cDNA的克隆：提取人成熟精子细胞总RNA，逆转录得 到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列 为上下游引物，PCR扩增两端分别带有Pst I和EcoR I酶切位点的CatSper1全 长cDNA，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火 1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物经纯 化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-CatSper1；